利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法
【专利摘要】本发明一种利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，包括以下步骤：(1)制备样品DNA溶液；(2)将引物包被在纸质微流体的反应区上，微流体包括由滤纸制成的反应层和至少一层加样层；加样层中心设有加样孔，围绕加样孔均布有多个反应孔，孔口上均涂覆有疏水材料，加样层重叠放置在反应层的上方；反应层上设有由疏水材料画出的与加样孔对应的样品区、与反应孔对应的多个反应区以及反应通道，反应区与反应孔的直径相同，样品区直径小于加样孔直径，反应区通过宽度从反应区到样品区逐渐变小的反应通道与样品区连通；(3)将反应液滴在加样孔中，加热微流体达到扩增温度；(4)观察反应区颜色变化即可得到检测结果。本发明成本低、结果准确。
【专利说明】利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微流体【技术领域】，特别是涉及一种利用纸质微流体进行核酸等温扩增 的方法及实施这种方法的装置。
【背景技术】
[0002] 以PCR为代表的核酸扩增技术一直在科研和临床工作中被普遍地使用。基于分子 生物学的快速发展，先后开发出了许多新的核酸等温扩增方法，例如：核酸序列依赖性扩增 法（NASBA)、自序列复制（3SR)、环介导等温扩增（LAMP)、链置换扩增法（SDA)等。但是传统 的PCR扩增需要昂贵的专门的扩增仪器，操作人员也需要专业的培训，检测成本高，由于扩 增仪器体积较大、重量较重，使得检测地点不能灵活移动。
[0003] -直以来，在一个平台上能简单、快速、准确、有效的进行多通道检测是医学、生 化、环境等各界学者们的共同期盼。微流体芯片技术（microfluidics technology)具有方 便、易于携带、高效、低耗（包括时间、标本、试剂）、分析微型化和实验通量化的特点，并且 通过结合传感或样品前处理模块，增加了分析检测的有效性，减少了交叉污染，为现场检测 或及时检测（P〇int-〇f-care，P0C)提供了一种快速诊断的方法。恒温微流体核酸扩增芯片 技术是一种创新性结合核酸等温扩增和微流控芯片的一种用于核酸快速扩增和结果肉眼 判定的新型技术。但是微流体器件一般采用半导体或集成电路加工模式实现，过程繁琐，工 艺复杂，迄今成本仍远不能达到用完即弃的目标。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用纸质微流体进行核酸等温扩 增的方法，该方法操作方便、不需要专门的核酸扩增仪器，扩增成本低，可同时进行多项检 测。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：一种利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，包 括以下步骤：
[0006] (1)制备待测样品DNA溶液；
[0007] (2)根据检测项目，将相应的引物包被在纸质微流体的反应区上，所述纸质微流体 包括由滤纸制成的反应层和至少一层加样层，所述加样层重叠放置在反应层的上方，所述 加样层中心设有加样孔，所述加样层上围绕加样孔均布有多个反应孔，所述加样孔和反应 孔的孔口上均涂覆有疏水材料；所述反应层上设有由疏水材料画出的与加样孔相对应的样 品区、与反应孔对应的多个反应区以及反应通道，所述反应区直径与反应孔的直径相同，所 述样品区的直径小于加样孔的直径，每个反应区通过一个反应通道与样品区连通，所述反 应通道的宽度从反应区到样品区逐渐变小；
[0008] (3)将步骤1制备的待测样品DNA溶液根据检测项目混合成扩增反应体系，滴加 在纸质微流体的加样孔中，加热纸质微流体使其温度达到核酸扩增所需要的温度并保持恒 温；
[0009] (4)扩增反应完成后，观察纸质微流体反应区的颜色变化，即可得到检测结果。
[0010] 采用上述技术方案，
[0011] 纸质微流体的加样孔和反应孔的孔口上均涂覆有疏水材料，反应层上设有由疏水 材料画出的与加样孔相对应的样品区、与反应孔对应的多个反应区以及反应通道，使得待 测样品溶液通过加样孔滴加到样品区后不能通过疏水材料扩散到滤纸层的其它地方，从而 将不同项目的检测隔开，一个微流体能同时进行多项不同的检测。
[0012] 作为优选地，所述步骤2中在纸质微流体的反应区上包被引物是通过生物素化引 物和亲和素化微凝胶偶联结合，室温干燥沉淀在反应区上。可以根据检测对象的不同，事先 在微流体反应区上包被对应的引物，实现检测目的。
[0013] 作为优选地，所述步骤2中的纸质微流体的加样层为两层以上，从上到下加样层 的加样孔的直径逐层缩小，所述样品区的直径小于最下层加样层的加样孔的直径。加样孔 的直径逐层缩小，使得微流体的中央形成一个由外往内直径逐渐缩小的孔，减少了样品被 滤纸吸收带来的损耗。
[0014] 作为优选地，所述步骤2中的纸质微流体的所有反应孔的圆心在同一圆周上，所 有反应区的圆心也在同一圆周上，使得微流体装置美观整洁，结果易于观察统计。
[0015] 作为优选地，所述步骤2中的纸质微流体上的疏水材料为石蜡或者二甲基硅氧烷 或者SU-8光阻胶。
[0016] 作为优选地，所述步骤3中加热纸质微流体的方法为将纸质微流体放入预先调好 温度的人工培养箱中，不需要其它设备，操作简单。
[0017] 作为优选地，所述步骤2中的纸质微流体还包括位于反应层下方的加热层，所述 加热层由滤纸制成，其下表面上设有电阻丝，可以连接电阻，接通电流后使纸层温度达到核 酸扩增反应所需温度。
[0018] 作为优选地，所述步骤3中加热纸质微流体的方法为电阻丝外接可变电阻，接通 电流，调节可变电阻，使得纸质微流体的温度达到扩增所需要的温度，可以根据扩增温度的 不同需要调节可变电阻达到不同温度。
[0019] 作为优选地，所述步骤2中的纸质微流体的加热层的电阻丝为由金属粉喷射沉淀 而成，电阻丝微细、体积小，能够和滤纸层紧密结合，且利于均匀分布使得纸层温度均匀。
[0020] 作为优选地，所述步骤2中的纸质微流体的加样层、反应层和加热层由双面胶层 粘贴叠加固定，其中所述加样层之间、加样层与反应层之间的双面胶层上设有与位于其上 方的加样层的加样孔和反应孔对应的孔，使得整个微流体结构稳固，各层不能移位避免造 成实验结果不准确。
[0021] 本发明的有益效果是：本发明的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，不需 要昂贵的核酸扩增仪器，用于等温扩增核酸的纸质微流体由滤纸制成，液体通过毛细血管 作用和液体灯芯作用在纸纤维间进行横向和纵向的流动，使得待测样品溶液能够和包被在 反应区的引物发生反应实现扩增目的。该纸质微流体重量轻、携带方便，可以根据需要将纸 质微流体带到不同地方进行现场检测，且该纸质微流体成本低廉，多个反应孔使得可以同 时检测同一对象的不同检测项目，可一次性使用；该纸质微流体可以通过导电层从外部接 入电源，使得纸层温度达到扩增温度的需要，也可以不要加热层直接将只由加样层和反应 层组装得到的微流体放入调好温度的人工培养箱中进行扩增反应，简化了该微流体的制备 过程、降低了成本。该扩增方法所需样品的体积小、分析速度快、成本低、可以根据需要进行 现场即时检测，具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是本发明的纸质微流体组装示意图。
[0023] 图2是本发明的纸质微流体的加样层结构示意图。
[0024] 图3是本发明的纸质微流体的反应层结构示意图。
[0025] 图4是本发明的纸质微流体的加热层结构示意图。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1利用纸质微流体同时进行七种菌的环介导等温扩增检测
[0027] 利用纸质微流体同时检测待测样品中是否含有以下七种菌：铜绿假单胞菌、副溶 血性弧菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌，采 用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP),按照如下步骤操 作：
[0028] -、提取样本的DNA溶液备用，采用水煮法快速提取核酸。
[0029] 二、将七种菌的LAMP引物分别沉淀在纸质微流体的七个反应区22上，不同菌检测 的基因和使用的引物如表1所示：通过生物素化引物和亲和素化微凝胶偶联结合，室温干 燥沉淀在反应区22上，剩下一个反应区22不包被引物作为阴性对照。
[0030] 表1七种菌的检测基因及对应的引物
[0031]
【权利要求】
1. 一种利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备待测样品DNA溶液； (2) 根据检测项目，将相应的引物包被在纸质微流体的反应区（22)上，所述纸质微流 体包括由滤纸制成的反应层（2)和至少一层加样层（1)，所述加样层（1)重叠放置在反应层 (2)的上方，所述加样层（1)中心设有加样孔（11)，所述加样层（1)上围绕加样孔（11)均 布有多个反应孔（12)，所述加样孔（11)和反应孔（12)的孔口上均涂覆有疏水材料；所述 反应层（2)上设有由疏水材料画出的与加样孔（11)相对应的样品区（21)、与反应孔（12) 对应的多个反应区（22)以及反应通道（23)，所述反应区（22)直径与反应孔（12)的直径相 同，所述样品区（21)的直径小于加样孔（11)的直径，每个反应区（22)通过一个反应通道 (23)与样品区（21)连通，所述反应通道（23)的宽度从反应区（22)到样品区（21)逐渐变 小； (3) 将步骤1制备的待测样品DNA溶液根据检测项目混合成扩增反应体系，滴加在纸质 微流体的加样孔中，加热纸质微流体使其温度达到核酸扩增所需要的温度并保持恒温； (4) 扩增反应完成后，观察纸质微流体反应区的颜色变化，即可得到检测结果。
2. 如权利要求1所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤2中在纸质微流体的反应区（22)上包被引物是通过生物素化引物和亲和素化微凝胶 偶联结合，室温干燥沉淀在反应区（22)上。
3. 如权利要求1所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤2中的纸质微流体的加样层（1)为两层以上，从上到下加样层（1)的加样孔（11)的直 径逐层缩小，所述样品区（21)的直径小于最下层加样层（1)的加样孔（11)的直径。
4. 如权利要求1所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤2中的纸质微流体的所有反应孔（12)的圆心在同一圆周上，所有反应区（22)的圆心 也在同一圆周上。
5. 如权利要求1所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤2中的纸质微流体上的疏水材料为石蜡或者二甲基硅氧烷或者SU-8光阻胶。
6. 如权利要求1所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤3中加热纸质微流体的方法为将纸质微流体放入预先调好温度的人工培养箱中。
7. 如权利要求1所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤2中的纸质微流体还包括位于反应层（2)下方的加热层（3)，所述加热层（3)由滤纸制 成，其下表面上设有电阻丝（31)。
8. 如权利要求7所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤3中加热纸质微流体的方法为电阻丝（31)外接可变电阻，接通电流，调节可变电阻，使 得纸质微流体的温度达到扩增所需要的温度。
9. 如权利要求7所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在于，所述 步骤2中的纸质微流体的加热层（3)的电阻丝（31)为由金属粉喷射沉淀而成。
10. 如权利要求1?9任一所述的利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法，其特征在 于，所述步骤2中的纸质微流体的加样层（1)、反应层（2)和加热层（3)由双面胶层（4)粘 贴叠加固定，其中所述加样层（1)之间、加样层（1)与反应层（2)之间的双面胶层（4)上设 有与位于其上方的加样层（1)的加样孔（11)和反应孔（12)对应的孔。
【文档编号】C12Q1/68GK104293945SQ201410528335
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】王欢, 府伟灵, 黄庆, 王云霞, 张立群, 黄君富 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院