Tp1基因3’utr区功能snp位点及其检测引物、试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种影响种公牛精液品质优劣的TP1基因3’UTR区功能SNP位点及其检测引物、试剂盒和检测方法。该SNP位点为：g.528G>A；核苷酸位置的编号基于GenBank登录号为AC_000159.1的牛TP1基因序列，且以TP1基因的起始密码子ATG作为+1；用于种公牛TP1基因3'UTR区功能SNP位点基因分型的引物，上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5所示；本发明还公开了检测该SNP位点的引物、试剂盒和方法。本发明首次阐明了TP1基因SNP位点与公牛精液品质优劣的相关性，减少种公牛饲养的盲目性，节约成本，增加经济效益。
【专利说明】TP1基因3'UTR区功能SNP位点及其检测引物、试剂盒和检 测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及家畜分子生物学【技术领域】，具体涉及一种影响种公牛精液品质优劣的 TPl基因3' UTR区功能SNP位点及其检测引物、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 在人工授精及冷冻精液等技术被广泛推广的今天，种公牛已经成为现代奶牛改良 体系中最重要的一环，其精液品质优劣是牛群能否可以快速稳定发展的指示标。公牛的采 精量、鲜精活力、冻精解冻后活力、鲜精密度和精子畸形率是国际公认的衡量种公牛精液品 质的重要指标。一项权威数据表明，我国的荷斯坦公牛年均冻精生产量仅仅为2. 18万份， 但在国外，最高的生产水平是一头公牛年产冻精25万份。这种巨大的差距，直接表明了我 国奶牛行业的实际水平还处在起步阶段，未来还有较长路要走。因此，如何提高公牛整体遗 传素质，解决公牛冻精质量差的问题，并进而培育大量良种公牛已迫在眉睫。然而，种公牛 精液品质属于数量性状，遗传力极低，过去的常规育种手段很难在较短时间内发挥作用。因 而，现在育种工作者们开始将目光聚焦到分子水平上以期解决这一问题，即借助标记辅助 选择（MAS)方法，研究与种公牛精液品质性状相关的候选基因，进一步分析与侯选基因紧 密连锁的分子标记，从而达到育种目的。
[0003] 单核苷酸多态性（SNP)是哺乳动物基因组最常见的变异类型，它们可以调控基因 的表达，从而对其作用的发挥产生影响，进而引起表型的差异。通常情况下，我们将SNP分 为三类，即编码区的SNP、基因间的SNP以及基因周边的SNP。基因3'UTR区的SNP便属于 基因周边SNP中的一种。研究表明，基因3' UTR的SNP主要影响MicroRNA与3' UTR结合， 促进或抑制基因翻译，发挥着重要的作用。
[0004] 种公牛过渡蛋白I (Transition protein 1，TP1)是精子中特异存在的一类富含精 氨酸和赖氨酸的蛋白，其主要参与了精子变态过程中组蛋白一鱼精蛋白转换这一标志性事 件。即体细胞的组蛋白逐渐被睾丸特异性的组蛋白I(HlT)替换，后再由过渡蛋白（TP)替 换Η1Τ，最后TP被鱼精蛋白（Prm)顺序性的替换，形成精子的核鱼精蛋白。由此看见，TPl 作为这一事件的参与者之一，对于牛精子正常发生是必需的。
[0005] 已有很多证据显示，在牛上，相关基因3'UTR区的SNP可以通过影响MicroRNA与 3' UTR结合，调节精液品质特征。如牛KATNAL1基因3' UTR SNP可以影响bta-miR-22-5p 对革El基因表达的调控，从而影响牛的精液品质特征（张晓建等，2014)，商青等（2014)在牛 TNP2基因上也发现类似的机制。但是，在牛TPl基因上至今未有相关SNP及MicroRNA作用 对精液品质特征影响的报道。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的是提出一种影响种公牛精液品质优劣的TPl基 因3' UTR区功能SNP位点，该SNP位点可以在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质 中进行应用。本发明还提供了该SNP位点的引物、试剂盒和检测方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
[0008] -种影响种公牛精液品质优劣的TPl基因3' UTR区功能SNP位点，所述SNP位点 为：g. 528G>A ;核苷酸位置的编号基于GenBank登录号为 AC_000159. 1(105576568. . 105577 158)的牛TPl基因序列，且以TPl基因的起始密码子ATG作为+1。
[0009] 上述TPl基因3' UTR区功能SNP位点在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品 质中的应用。该种公牛TPl基因3' UTR区SNP g. 528G>A可作为功能性分子标记，继而对种 公牛精液品质产生影响。经细胞瞬时转染实验验证，通过双荧光素报告系统进行分析，结 果表明，TPl基因3' UTR区SNP能够改变bta-miR-532结合能力，突变后3' UTR区靶序列与 bta-miR-532的结合能力比突变前增强，这样使TPl在突变前后呈现出不同表达水平，从而 影响种公牛精液品质的优劣。
[0010] 一种用于检测TPl基因3' UTR区功能SNP位点的引物，上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 一种用于检测种公牛TPl基因3'UTR区功能SNP位点基因分型的引物，上游引物 GF序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物GR序列如SEQ ID NO. 5所示。PCR所扩增的片段 含有牛TPl第528位核苷酸（PCR扩增的片段序列如SEQ ID NO. 6所示）。
[0012] 一种用于种公牛精液品质优劣筛选的试剂盒，包括：上游引物GF(K) μ mol/L)，其 序列如SEQ ID NO. 4所示；下游引物GR(IOymoVL)，其序列如SEQ ID NO. 5所示；上述引 物能够扩增出序列如SEQ ID NO. 6所示的片段；2XTaq PCR MasterMix ;ddH20;FastDigest 限制酶 Taq I ;10XFastDigest buffer。
[0013] 一种用于种公牛精液品质优劣筛选的方法，以种公牛基因组DM为模板，利用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的引物对待检测的种公牛的TPl基因3' UTR区进行扩增，将 PCR产物用FastDigest限制酶Taq I进行切割，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，并最终 根据银染后的电泳结果进行判定：对于TPl基因3' UTR区SNP位点（g. 528G>A)，共有三种基 因型，分别是GG基因型（电泳显示仅有一条283bp的带，24bp的带分子量太小在电泳图中 不显示），GA基因型（电泳显示有307bp，283bp两条带，24bp的带分子量太小在电泳图中不 显示）以及AA基因型（电泳显示仅有307bp-条带）。其中GG基因型可使bta-miR-532 与TPl基因3'UTR结合能力降低，有利于TPl的表达，且SAS统计分析显示GG基因型的种 公牛个体的一次射精量显著高于AA基因型个体（P〈0. 05)，GG基因型种公牛个体畸形率要 显著低于GA、AA基因型个体（P〈0. 05)。因此GG基因型具有优良的精液品质性状，可作为 有效的种公牛分子标记。
[0014] 上述所用的种公牛基因组DNA，是通过苯酚/氯仿抽提法或高盐法提取得来，并最 终将其浓度稀释至50ng/l·! 1，-20°C保存备用。
[0015] 上述是25 μ I PCR扩增反应的体系，主要包括：上游引物GF(如SEQ ID NO. 4所 示）和下游引物GR(如SEQIDN0·5所示）各lμl，引物浓度为10μmol/L;2XTaqPCR MasterMixl2. 5 μ 1 ;模板 DNA 1 μ 1，DNA 浓度为 50ng/ μ I ;ddH20 9. 5 μ 1。
[0016] 上述PCR扩增反应的条件是：第一步预变性，温度94°C，时间5min ;第二步35个循 环，包括94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸20s ;第三步终延伸，温度72°C，时间10min。
[0017] 上述所用的FastDigest限制酶Taq I，用于识别TPl基因3' UTR区SNP位点 (g. 528G>A)。
[0018] 上述是10 μ I的FastDigest限制酶Taq I的酶切体系：PCR产物2· 5 μ 1， FastDigest 限制酶 Taq I 0.5 μ 1，IOXFastDigest buffer 2 μ l，ddH20 5 μ 1。
[0019] 上述FastDigest限制酶Taq I的酶切反应条件是：37°C，30min。
[0020] 上述聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的凝胶的质量浓度为：1〇%。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] (1)本发明的用于筛选种公牛精液品质优劣的方法，既涉及到SNP对MicroRNA结 合能力的影响，又运用了统计学手段进行分析，二者相互结合，大大增加了结果的可靠性， 且具有新颖、低成本等优点。
[0023] (2)本发明提供了一种应用性极强的新型试剂盒，利用种公牛TPl基因3'UTR区 SNP位点（g.528G>A)进行种公牛精液品质优劣的筛选。GG基因型作为优良精液品质特征 的有效分子标记，予以留种。应用该试剂盒可增加检测效率，减少了检测的盲目性，使成本 费用更低、操作更加简单化。在实际中，可以大规模用于早期对种公牛筛选，淘汰部分精液 品质不合格的种公牛，缩短育种所用时间，以期可以积极的推动我国奶牛行业的发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1 :种公牛TPl基因3' UTR区SNP位点（g. 528G>A)的测序图及位置；
[0025] 图2 :种公牛TPl基因3' UTR区SNP g. 528G>A在突变前后和bta-miR-532结合的 自由能变化示意图；
[0026] 图3 :种公牛TPl基因3' UTR区SNP位点（g. 528G>A)在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的基因分型图；
[0027] 图4 :细胞瞬时转染实验验证g. 528G>A对bta-miR-532与牛TPl基因3' UTR区结 合的影响。
【具体实施方式】
[0028] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0029] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等 人，分子克隆：实验手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0030] 实施例1 :种公牛TPl基因3' UTR区SNP的鉴定及功能验证
[0031] 1.采集500头种公牛血液或精液（本发明所使用的种公牛精液或血液取自北京 奶牛中心、上海光明荷斯坦牧业有限公司、山东奥克斯种公牛站）。采用苯酚/氯仿抽提法 提取血液基因组DNA，依照高盐法提取精液基因组DNA，然后利用紫外分光光度计对提取的 DNA样品进行纯度和浓度的检测，并最终稀释成50ng/ μ 1，-20°C保存备用。
[0032] 2.以牛精液基因组DNA为模板，利用Primer Premier5.0软件设计引物TPl-F (如 SEQ ID NO. 1所示）和TPl-R (如SEQ ID NO. 2所示），进行PCR扩增，扩增后的序列如SEQ ID NO. 3所示。PCR扩增产物直接测序，测序结果与GenBank登录号为AC_000159. 1 (10557 6568…105577158)的牛TPl基因序列进行比对，发现1个SNP位点g. 528G>A (以TPl基因 的起始密码子ATG作为+1)，位于TPl基因3' UTR区域内。
[0033] 3.利用 miRNA 在线预测软件 TargetScan(http://www. targetscan. org/index. htmL)预测与TPl基因3' UTR区域SNP结合的miRNAs。结果表明TPl基因3' UTR上的SNP g. 528G>A位于bta-miR-532的种子区，可与突变型AA的TP13' UTR片段结合，且突变前后和 bta-miR-532结合的自由能发生变化，结果如图2所示。通常情况下自由能越小，结合能力 越强，因此，结合图2可以得出突变后牛TPl基因3' UTR区与bta-miR-532的结合能力可能 比突变前增强。
[0034] 4.利用创造酶切位点的方法，设计出特异性的专用分型引物GF(如SEQ ID NO. 4 所示）和GR (如SEQ ID NO. 5所示），使牛TPl第528位碱基G - A突变（g. 528G>A)可以 被FastDigest限制酶Taq I识别。以种公牛基因组DNA为模板，利用上述特异性的专用分 型引物GF (如SEQ ID NO. 4所示）和GR (如SEQ ID NO. 5所示）进行PCR扩增，扩增后的 序列如SEQ ID NO. 6所示。PCR扩增产物经FastDigest限制酶Taq I切割后，在10 %的聚 丙烯酰胺凝胶电泳中予以分型。分型结果如图3所示。三种基因型分别为：GG基因型（电 泳显示仅有一条283bp的带，24bp的带分子量太小在电泳图中不显示），GA基因型（电泳 显示有307bp，283bp两条带，24bp的带分子量太小在电泳图中不显示）以及AA基因型（电 泳显示仅有307bp -条带）
[0035] 5.利用细胞瞬时转染实验对上述预测结果进行验证，分别将含有野生型（GG)和 突变型（AA)的3' UTR片段与pMIR载体连接，构建3' UTR荧光素酶表达质粒，并对应命名为 pMIR-3' UTR-G和pMIR-3' UTR-A ;同时，构建bta-miR-532质粒。随后将3' UTR荧光素酶表 达质粒pMIR-3' UTR-G和pMIR-3' UTR-A，分别与bta-miR-532质粒、内参β -gal质粒共转 染小鼠睾丸间质细胞（MLTC-I)，培养36小时后，通过双荧光素报告系统进行分析，结果如 图4所示。野生型质粒的活性高于突变型的质粒，这和上述的预测结果一致。说明突变后 即AA基因型时，bta-miR-532与牛TPl基因3'UTR区结合能力比突变前即GG基因型时强， 从而使TPl基因表达量降低。TPl基因的低表达不利于种公牛精液品质的提商，因此再次可 以认定GG基因型是有利的分子标记，AA基因型为不利的分子标记。
[0036] 实施例2 :牛TPl基因3' UTR区SNP分子标记与种公牛精液品质的关联分析
[0037] 利用统计学软件SAS 9. 0,比较分析牛TPl基因3' UTR区SNP (g. 528G>A)的不同基 因型与种公牛精液品质的相关性。其模型为：Yijk= μ+Α+Υ^^+θ#。Yijk为公牛精液品质 性状的观察值；μ为群体平均值；Gi:基因型的固定效应；Yj :季节的固定效应；Hk :场次的 固定效应；eijk :随机残差效应。以期通过此关联分析，选择优质精液品质的基因型个体进行 留种。
[0038] 关联性分析的结果如表1所示，可以得出结论：野生（GG)基因型的种公牛个体的 一次射精量显著高于突变（AA)基因型个体（P〈0. 05)，野生（GG)基因型的种公牛个体的精 子畸形率显著低于杂合（GA)和突变（AA)基因型个体（P〈0. 05)。同时野生（GG)基因型比 突变（AA)基因型种公牛个体的鲜精活力、鲜精密度和冻后活力都相对高。因此，野生（GG) 基因型是高精液品质的有利基因型，可以在种公牛育种改良过程中作为有效地功能性分子 标记，用于辅助选择具有优良精液品质特征的种公牛个体。
[0039] 表1种公牛TPl基因3' UTR区SNP g. 528G>A的不同基因型与种公牛精液品质的 关联分析
[0040]
【权利要求】
1. 一种影响种公牛精液品质优劣的TP1基因3'UTR区功能SNP位点，其特征在于， 所述SNP位点为：g. 528G>A ;核苷酸位置的编号基于GenBank登录号为AC_000159. 1，在 105576568与105577158之间的牛TP1基因序列，且以TP1基因的起始密码子ATG作为+1。
2. 权利要求1所述的TP1基因3' UTR区功能SNP位点在筛选和鉴定种公牛是否具有优 质的精液品质中的应用。
3. -种用于检测种公牛TP1基因3' UTR区功能SNP位点的引物，其特征在于，上游引物 的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 权利要求3所述的引物在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质中的应用。
5. -种用于检测种公牛TP1基因3' UTR区功能SNP位点基因分型的引物，其特征在于， 上游引物序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 5所示。
6. 权利要求5所述的引物在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质中的应用。
7. 采用权利要求5所述的引物进行种公牛精液品质优劣筛选的方法，其特征在于，以 种公牛基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的引物对待检测的种公 牛的TP1基因3'UTR区进行扩增，将PCR产物用FastDigest限制酶Taq I进行切割，聚丙 烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，并根据银染后的电泳结果进行判定：若得到283bp -条带， 则为GG基因型；若得到307bp，283bp两条带，则为GA基因型；若得到307bp-条带，则为 AA基因型；其中，GG基因型具有优良的精液品质性状，作为种公牛精液品质优劣筛选的分 子标记。
8. -种用于种公牛精液品质优劣筛选的试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述的 引物。
9. 如权利要求8所述的用于种公牛精液品质优劣筛选的试剂盒，其特征在于，包括： 上游引物10μmol/L，其序列如SEQIDN0·4所示 ；下游引物10μmol/L，其序列如SEQID NO. 5所示；上述引物能够扩增出序列如SEQ ID NO. 6所示的片段；2XTaq PCR MasterMix ; ddH20;FastDigest 限制酶 Taq I ;10XFastDigest buffer。
【文档编号】C12Q1/68GK104293951SQ201410531776
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】鞠志花, 张帅, 王长法, 张燕, 王秀革, 黄金明, 李建斌, 仲跻峰 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心