一种重组尿酸酶的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种适合大肠杆菌分泌表达重组产朊假丝酵母尿酸酶(uricase,EC1.7.3.3)核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞以及从该工程细胞纯化重组产朊假丝酵母尿酸酶的方法。本发明基于尿酸酶基因的天然序列，对其密码子进行了优化，将改造后的尿酸酶基因克隆到原核表达载体pET42a(+)中，转化大肠杆菌Rossetta菌株，经IPTG诱导，表达水平可达大肠杆菌可溶性蛋白的50％，而且所表达的蛋白为可溶性蛋白，其生物学活性高达37.89U/mg重组蛋白。本发明可高效、简便、低成本地获得重组产朊假丝酵母尿酸酶纯品。本发明还包括通过上述方法制备的重组重组产朊假丝酵母尿酸酶在制备治疗与人体高尿酸相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的应用。CGMCC 974520140929CGMCC 974620140929
【专利说明】一种重组尿酸酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用DNA重组技术在大肠杆菌中高效表达产朊假丝酵母尿酸酶重组 蛋白和采用相关蛋白质纯化技术分离纯化重组尿酸酶的方法，含有由该方法制备的尿酸酶 重组蛋白及其用途，属于基因工程和蛋白质生物化学领域。
【背景技术】
[0002] 随着人民生活水平的提高，高蛋白质类食物的摄入量逐年增加，高尿酸血症和痛 风的发病率也逐渐上升，高尿酸血症和痛风与肥胖症、高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉粥 样硬化等疾病呈显著正相关，而痛风不仅可以侵犯骨和关节，还容易累及肾脏和心血管系 统，危害极大。
[0003] 尿酸酶是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，能催化尿酸的分解，也可以溶 解已经沉淀的尿酸晶体。人和大多数的灵长类动物（如大猩猩、猿等）在进化过程中经过 基因突变的自然选择，编码尿酸酶的基因发生突变，不能合成有生物活性的尿酸酶，而以尿 酸作为嘌呤代谢的终产物，容易导致高尿酸血症和痛风。
[0004] 日前临床治疗的主要措施有控制急性发作；纠正高尿酸血症，防止关节炎复发； 预防尿酸盐沉积造成的关节破坏、肾脏损害及痛风石的形成。而尿酸酶制剂的使用使治疗 效果得到了很大的提高，尿酸酶制剂是一种从产尿酸酶的真菌（如黄曲霉）培养物中提 取的非重组性尿酸酶，降解尿酸的作用强于别嘌呤醇，但因其潜在的免疫原性，限制了其 临床应用。近年来，随着基因工程技术在药学方面的应用，国外已上市了基因工程尿酸酶 (rasburicase)，其cDNA来源于黄曲霉，在酿酒酵母中表达，降解尿酸的效果良好。但存在 用量大（0. 2mg/kg体重）的缺点，而且有许多不良反应，如发热、恶心、呕吐、皮疹、头痛和过 敏等。
[0005] 从黄曲霉提取的天然尿酸酶己经在欧洲上市使用有20年的历史，经注射给药用 于治疗与白血病化疗有关的严重高尿酸血症。美国也于1997年开始将该产品用于白血病 患者。与别嘌醇相比，尿酸酶降低血尿酸水平迅速而专一。痛风病人给予尿酸酶可阻断急 性发作并减小痛风石的体积。从培养的黄曲霉提取尿酸酶不但培养周期长、产率低，而且容 易受病原体污染。
[0006] Laboureur等(LaboureurP,LangloisC.Urateoxidaseof Aspergillusflavus.I.Isolation,purification,properties.BullSocChim Biol(Paris). 50 (4) : 811-825 (1968))首次从黄曲霉培养物中提取了尿酸酶，并用于降低 人体内尿酸的浓度，为尿酸酶的应用打下了基础。然而，从微生物中直接提出尿酸酶，产量 极低，这极大地限制了它的临床应用，而且这种异源性的蛋白质有一定的免疫原性，长期 使用会产生免疫反应。Montalbini等（MontalbiniP，ElstnerEF.Ethyleneevolution byrust-infected,detachedbean(PhaseolusvulgarisL.)leavessusceptibleand hypersensitivetoUromycesphaseoli(Pers.)Wint.Planta135(3):301-306 (1977))从 鹰嘴豆、蚕豆和小麦的叶子中纯化得到电泳匀一性的尿酸酶。
[0007] 基因工程技术为大量制备尿酸酶开辟了新的道路。1992年，Legoux等（Legoux R,DelpechB,DumontX,GuillemotJC,RamondP,ShireD,CaputD,FerraraP,Loison G1992.CloningandexpressioninEscherichiacoliofthegeneencoding Aspergillusflavusurateoxidase.JBiolChem267(12) :8565_8570(1992))克隆了 黄曲霉尿酸酶基因，并在大肠杆菌中尝试表达，产物以可溶解的形式在胞内表达，并且具 有酶活性，但表达量低，只有菌体全蛋白的4%，不具有产业化开发价值。天然黄曲霉尿酸 酶N端乙酰化有利于酶的稳定及抵抗蛋白酶降解，这对培养周期长的表达系统十分重要， 但对活性并不是必须的。同年，Chevalet等（ChevaletL，TirabyG，CabaneB，Loison G.TransformationofAspergillusflavus:constructionofurateoxidase-deficient mutantsbygenedisruption.CurrGenet21(6) :447_453(1992))用尿酸酶缺陷的黄 曲霉菌株进行表达，结果转化菌株不能以尿酸为唯一氮源，而且容易恢复为野生型。而 LePlatois等(LeplatoisP,LeDouarinB,LoisonG.High-levelproductionofa peroxisomalenzyme:Aspergillusflavusuricaseaccumulatesintracellularly andisactiveinSaccharomycescerevisiae.Gene122 (1) : 139-145. (1992))在这一 年取得了很大进展，他们在酿酒酵母中表达黄曲霉尿酸酶基因，表达量达到13%。另外 2000 年，Hongoh等（HongohY,SasakiT,IshikawaH2000.Cloning,sequenceanalysis andexpressioninEscherichiacoliofthegeneencodingauricasefromthe yeast-likesymbiontofthebrownplanthopper,Nilaparvatalugens.InsectBiochem MolBiol30(2):173-182.)将Nilaparvatafugens尿酸酶基因在大肠杆菌进行融合表达， 90 %的目标蛋白以包含体形式存在，表达量估计有20 %。
[0008] 尽管尿酸酶药物开发研究成为高尿酸疾病药物开发的热点，但到到目前为止，只 有法国Sanofi-Synthelabo公司的产品获准上市，但仍未进入中国市场。我们从2010年开 始研究重组尿酸酶，到目前为止，我们已成功地在大肠杆菌中高效表达了尿酸酶，并建立了 稳定的生产工艺。并在尿酸酶的基础研究方面取得了一定的成绩。
[0009] 根据发明人的知识，现有技术还没有解决在大肠杆菌高效融合表达尿酸酶的方 法，同时提供一种制备高纯度、高活性和高回收率的纯化重组尿酸酶可溶尿酸酶的方法。
【发明内容】
[0010] 基于现有技术存在的缺欠，本发明的第一目的在于提供一种将编码产朊假丝酵母 尿酸酶的核苷酸序列、其经过密码子优化后，将其克隆于表达载体中，将该表达载体转化进 入大肠杆菌细胞，发酵培养该大肠杆菌细胞并融核表达产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白、分 离纯化制备重组尿酸酶可溶蛋白的方法。
[0011] 本发明的发明人惊奇地发现，将获得编码SEQIDN0 :4与其具有85%以上同一 性的氨基酸序列所示天然产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白的SEQIDN0. 3所示的天然核苷酸 序列或与其具有50%以上同一性的核苷酸序列，或编码SEQIDN0 :6或与其具有85%以上 同一性的氨基酸序列所示的产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白的SEQIDN0. 5所示的经过密码 子优化的核苷酸序列克隆入PET表达载体中，可以意外地获得高融合表达的产朊假丝酵母 尿酸酶重组蛋白，且使用该载体表达的产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白易于纯化，纯度高、收 量大，活性高。
[0012] 在本发明的又一个方面，提供了一种编码SEQIDNO:4天然产朊假丝酵母尿酸酶 重组蛋白的氨基酸序列的SEQIDN0. 3所示的天然核苷酸序列，或者编码SEQIDN0 :6产 朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白的氨基酸序列的SEQIDN0. 5所示的经过密码子优化的核苷酸 序列，上述核苷酸序列能够在PET表达载体中高融合表达。
[0013] 在本发明的再一个方面，提供了一种表达载体，它含有本发明上述的核苷酸序列， 优选地，所述表达载体为pET42a(+)。
[0014]在本发明的再一个方面，提供了一种工程细胞，它是通过所述表达载体序列转化 宿主细胞而获得的，且表达载体中整合有编码产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白的核苷酸序 列。
[0015]优选地，所述的工程细胞是大肠杆菌菌株为DH5a或R0ssetta，更优选为Rossetta。
[0016] 在本发明的进一步方面，提供了一种制备产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白的表达 方法，包括以下步骤：在适合表达条件下，培养本发明上述的宿主细胞，从而分泌表达产朊 假丝酵母尿酸酶重组蛋白；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌菌株为Rossetta。所述培 养包括：培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到0D600,诱导期时间为 8-12hrs，发酵及诱导温度保持在37°C，IPTG用量为0. 1-lmM/L，诱导期的pH值为6-8。所 述大肠杆菌宿主细胞包括可以用IPTG诱导合成产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白，并且能够 分泌到细胞壁与原生质膜间隙的大肠杆菌细胞。
[0017] 在本发明的另一个方面，对表达后产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白进行了粗提和进 一步纯化。其包括如下步骤：（1)对发酵样品通过离心和/或过滤方式收集菌体，用超声或 溶菌酶破碎菌体，再通过离心方法获得上清液，（2)通过硫铵分级沉淀初步纯化后，和进一 步通过阴离子交换、疏水层析方法，获得纯度达到95%以上（如95-99. 9% )的纯品，本发 明所制备的产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白活性在30U以上。
[0018] 在本发明的另一个方面，提供了产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白在制备治疗与人体 高尿酸相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的用途。所述尿酸酶重组蛋 白包含任一如下氨基酸序列或与其具有85%以上同一性的氨基酸序列：
[0019]a)SEQIDN0. 4所示氨基酸序列；或
[0020] b)SEQIDN0. 6所示氨基酸序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1用于用于克隆本发明的编码本发明信号肽的核苷酸序列的正向引物。
[0022] 图2用于用于克隆本发明的编码本发明信号肽的核苷酸序列的反向引物。
[0023] 图3显示用于编码产朊假丝酵母尿酸酶的核苷酸序列。
[0024] 图4本发明天然产朊假丝酵母尿酸酶的氨基酸序列。
[0025] 图5显示用于编码本发明重组产朊假丝酵母尿酸酶的核苷酸序列。
[0026] 图6本发明重组产朊假丝酵母尿酸酶的氨基酸序列。
[0027]图 7pET42a(+)载体图谱
[0028] 图8尿酸酶基因的PCR扩增产物
[0029] 1 道：DNAMarker;
[0030] 2道：野生型产朊假丝酵母尿酸酶的基因；
[0031] 3道：序列优化后的尿酸酶编码序列的PCR产物。
[0032] 图9表达产物的SDS-PAGE鉴定
[0033]A野生型产朊假丝酵母尿酸酶1道：Marker2道：诱导前3道：诱导后
[0034]B序列优化后的尿酸酶1道：诱导前2道：诱导后3道:Marker
[0035] 图10离子交换层析纯化图谱
[0036]A野生型产朊假丝酵母尿酸酶
[0037] B序列优化后的尿酸酶
[0038] 图11凝胶过滤层析纯化图谱
[0039] A野生型产朊假丝酵母尿酸酶
[0040] B序列优化后的尿酸酶
[0041] 图12重组尿酸酶的表达与纯化
[0042]A序列优化后的尿酸酶
[0043] 1 道：蛋白质Marker
[0044] 2道：诱导前
[0045] 3道：诱导后
[0046] 4道：诱导后沉淀
[0047] 5道：诱导后上清
[0048]6道：硫酸铵沉淀
[0049] 7道：脱盐后
[0050] 8道：离子交换后
[0051]9道：分子筛后
[0052]B野生型产朊假丝酵母尿酸酶
[0053] 1 道：蛋白质Marker
[0054] 2道：诱导后上清
[0055] 3道：诱导后沉淀
[0056] 4道：硫酸铵沉淀
[0057] 5道：硫酸铵沉淀上清
[0058]6道：离子交换后
[0059] 7道：离子交换后组分2
[0060] 8道：分子筛后
[0061] 图13纯化后重组尿酸酶的质谱鉴定
【具体实施方式】
[0062] 为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某 些方面、模式、实施方式、变型和特征。
[0063] 在实施本发明的过程中，使用了分子生物学、基因工程学、遗传学、细胞分子 生物学、生物化学、蛋白质生物化学、蛋白质生物化学工程、制药工艺学、医学、生理学、 病理学、动物实验学，Sambrook等（MolecularCloning:ALaboratoryManual, 2nd edition, 1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)等很多传统技术和基础理论。这 些技术是熟知的。
[0064] 在本发明的一个实施方式中，提供了一种产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白，其特征 在于，所述尿酸酶重组蛋白包含任一如下氨基酸序列或与其具有85%以上同一性的氨基 酸序列：
[0065] a)SEQIDN0. 4所示氨基酸序列；或
[0066] b)SEQIDN0. 6所示氨基酸序列。
[0067] 在本发明的又一个实施方式中，通过分子克隆提供编码所述产朊假丝酵母尿酸酶 重组蛋白的核苷酸序列。
[0068] 本发明的术语"核苷酸序列"包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地， 其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的 酶或蛋白的核苷酸序列。本文所用的术语"核苷酸序列"是指寡核苷酸序列或多核苷酸序 列和其变体、同源物、片段和衍生物（如其部分）。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合 成物或重组物，其可以是双链的或单链的（无论其代表正义链还是反义链）核酸分子。
[0069] 在本发明的一个【具体实施方式】中，提供了一种分离的核酸分子，其中，所述分离的 核酸分子包含任一如下核苷酸序列或与其具有：
[0070] a)SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；或
[0071]b)与SEQIDN0. 2所示的反义核苷酸序列；或
[0072] c)编码SEQIDN0:4的氨基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0073] d)编码SEQIDN0:6的氨基酸序列的SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列。编码具有 如本文所定义的酶或蛋白的核苷酸序列可以从产生所述酶或蛋白的任何细胞或生物中分 离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。本文仅为举例性质，例如利 用强变性剂提取总RNA，利用转录和反转录方法，产生所述酶或蛋白的生物的染色体DNA或 信使RNA(mRNA)来构建基因组DNA和/或cDNA文库。
[0074] 还有，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述酶或蛋白的核苷酸序 列，再如，利用自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的 载体中。
[0075] 因此，所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA 来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或 cDNA的片段根据需要而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述 DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应（PCR)来制备。
[0076] 本文中术语"PCR"被称之为聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR) 是指在DNA聚合酶的催化下，通过变性、退伙，聚合扩增等反复循环达到几何数量级扩增位 于两段已知序列之间的DNA区段。
[0077] 可以使用本发明的多核苷酸（核苷酸序列）制备引物，如PCR引物，用于可选扩增 反应的引物；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、和其它片段的长度可以是至少 12个、如至少15个，优选为至少20个、如至少25个、30个、35个或40个核苷酸，且其也涵 盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。
[0078] 通常，使用重组DNA技术（即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质 的酶或蛋白的核苷酸序列。因此，在本发明的一个可选实施方式中，可以使用本领域已知的 化学方法来合成全部或部分核苷酸序列。
[0079] 通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制 备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。引物 设计可以根据提高纯度需要考虑在目的蛋白N端或C端的核苷酸序列加入编码标签蛋 白（Tagged-proteinexpressionsystem)的核苷酸序列，常见的标签蛋白包括但不限于 His-tag蛋白，Flag-tag蛋白，GST-tag蛋白等。
[0080] 可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多 核苷酸（如DNA多核苷酸）。它们也可以通过标准技术进行克隆。通常使用重组方法，如使 用PCR(聚合酶链式反应）克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆 的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物（如约12至40个核苷酸），使引物接触从人参中获 得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段 (如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物），并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含适 合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
[0081] 如上所述，可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据 本发明的多核苷酸（如DNA多核苷酸）。它们也可以通过标准技术进行克隆。通常使用重 组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应）克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于 所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物（如约15至30个核苷酸），使引物接触从 人参中获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩 增的片段（如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物），并回收扩增的DNA。可以设计引入使 其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。酶切 位点的设计可以根据载体克隆位点和编码具有本文所定义的特定性质的酶或蛋白的核苷 酸序列来设定，往往在前面加入若干个保护碱基，详细参考PR0MEGA公司提供的保护碱基 设定参考手册。
[0082] 在本发明的一个【具体实施方式】中，所述产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白通过表达任 一以下所示的核苷酸序列或与其具有50%以上同一性的核苷酸序列而获得：
[0083]a)编码SEQIDN0:4的氨基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0084]b)编码SEQIDN0:6的氨基酸序列的SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列。
[0085] 如本文所定义的编码产朊假丝酵母尿酸酶的核苷酸序列和信号肽序列可以存在 于载体中，在该载体中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列，使得所述调控序列能够 通过适合的宿主细胞（如大肠杆菌）表达所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。本发 明的载体可以被转化到上述的适合宿主细胞中，以表达具有如本文所定义的产朊假丝酵母 尿酸酶重组蛋白。通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体（如质粒、粘粒、病毒或噬菌 体载体、基因组插入物）。本发明可以涵盖发挥等同功能且本领域已知或可知的其它形式的 表达载体。一旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并 发挥功能，或可以自行整合进入基因组。
[0086] 所述载体可以包含一个或多个选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因，如提 供氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。载体可以在体外使 用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。
[0087] 表达载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述 载体可以是PET1-46系列载体（N0VAGEN公司）、pGEX系列载体、pUC系列载体、pACYC系 列载体、pUB系列载体、pE系列载体、pAMB系列载体和plj系列载体。优选为N0VAGEN公司 的pETl-46系列载体，最优选为pET42a(+)。
[0088] 上述核苷酸序列的检测是通过核苷酸序列测序仪来完成，同时通过各种分子 生物学软件来分析所得到的基因是否是目的基因。常用分析软件有GENTYX，Vector NTI，GenDOC，DNAman，也可以借助于BLAST和FASTA进行离线和/或在线搜索和检索分析用 以比对核苷酸序列和蛋白质序列。
[0089] 模建的同时，将分别由SEQIDNo. 3和5所示cDNA序列以及由其克隆推测 的SEQIDNo. 4和6氨基酸序列与数据库（例如Kabat数据库（参见Johnsonet al.，2000,NucleicAcidsRes.28:214_218.)和GenBank等）中的序列进行比较。例 如Smith-Waterman算法（Gusfield, 1997,in"AlgorithmsonStrings,Trees,and Sequences，'，CambridgeUniversityPress,Cambridge)或者BLAST(Karlinet al.，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268)等可以寻找到与上述整体核苷酸序列 同一性为至少约50 %，至少约60 %，至少约70 %，至少约80 %，至少约85 %，至少约90 %或 至少约95%的密码子优化的核苷酸序列；或者可以找到与上述整体氨基酸序列同一性为 至少约85 %，至少约90 %，至少约95 %，至少约98 %或至少约99 %或者完全相同（100 % ) 的氨基酸序列。
[0090] 本文所使用的术语"酶"与术语"氨基酸序列"和/或术语"多肽"和/或术语"蛋 白"同义。在一些实例中，术语"氨基酸序列"与术语"肽"和/或"酶"同义，可以互为替代 使用。
[0091] 本文所使用的术语"产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白"与术语"融和表达的产朊假丝 酵母尿酸酶重组蛋白"和术语"尿酸酶重组蛋白"和/或"重组尿酸酶"同义，可以互为替代 使用。
[0092] 本文中的术语"细胞"包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性 质的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何细胞，其与术语"生物"和/或术 语"细菌"和/或术语"微生物"和/或术语"细菌微生物"同义，互为替换使用。
[0093] 与本发明有关的术语"工程细胞"或"转化的宿主细胞"包括任何包含编码具有如 本文定义的特定性质的蛋白或酶以及酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其获得的产物的细 胞，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列 在所述生物内表达。优选核苷酸序列被引入到生物的基因组中。术语"转基因生物"不涵 盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然 核苷酸编码序列。因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或组合的生物：编码具 有如本文定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、 本文定义的质粒、本文定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本 文定义的特定性质的酶或蛋白且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并 不与产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白编码基因相连。
[0094] 在本发明的再一个实施方式中，提供一种工程细胞，其中所述工程细胞是通过转 化上述表达载体进入宿主细胞后获得的细菌细胞。
[0095] 所述宿主微生物可以是原核或真核生物。本发明的产朊假丝酵母尿酸酶 重组蛋白的核苷酸序列可获自于，包括但不限于以下属的细菌微生物：埃希氏菌属 (Escherichia)、分枝杆菌属（Mycobacterium)、链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌 属（Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属（Desulfitobacterium)、芽抱杆菌属（Bacillus)、 弯曲杆菌属（Campylobacter)、弧菌属（Vibrionaceae)、木杆菌属（Xylella)、硫化 叶菌属（Sulfolobus)、气单胞菌属（Aeromonas)、链霉菌属（Streptomyces)、酵母菌 属（Saccharomyces)、乳球菌属（Lactococcus)、、曲霉属（Aspergillus)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、李斯特菌属（Listeria)、奈瑟氏球菌属（Neisseria)、中慢生根 瘤菌属（Mesorhizobium)、雷尔氏菌属（Ralstonia)、黄单胞菌属（Xanthomonas)和假丝酵 母属（Candida);优选为埃希氏菌属（Escherichia).优选为埃希氏菌属（Escherichia)。
[0096] 适宜地，本发明的产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白或者编码产朊假丝酵母尿酸酶 重组蛋白的核苷酸序列可以获自于，优选获自于以下细菌微生物：大肠杆菌（E.coli)、芽 抱杆菌（Bacillussp)、空肠弯曲杆菌（Campylobacterjejuni)、弧菌（Vibrionaceae)、 苛养木杆菌（Xylellafastidiosa)、硫横矿硫叶菌（Sulfolobussolfataricus)、酿 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila)、杀鲑 气单胞菌（Aeromonassalmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、 龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus)、分枝杆菌（Mycobacterium)、化脓性链球 菌（Streptococcuspyogenes)、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)、青枯雷尔氏菌 (Ralstoniasolanacearum)、野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris)、地毯草黄单胞 菌（Xanthomonasaxonopodis)、近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis)、嗜热链球菌 (Streptococcusthermophilus)、瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus)、脱齒脱亚硫 酸菌（Desulfitobacteriumdehalogenans)、土曲霉（Aspergillusterreus)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、无害李斯特菌（Listeriainnocua)、单核细胞增多性李斯 特菌（Listeriamonocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriameningitidis)、百脉根 中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumloti)。优选为大肠杆菌细胞，更优选为DH5a和Rossetta 大肠杆菌细胞，最优选为Rossetta大肠杆菌细胞。
[0097] 在一个实施方式中，根据本发明的产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白可获自于，优 选获自于大肠杆菌BL21JZY003和BL21JZY004(分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia Coli)，所述大肠杆菌菌株JZY003或JZY004由吉林省金梓源生物技术有限公司根据国际承 认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter(地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)保藏日为2014 年09月29日，保藏号为CGMCC9745和CGMCC9746,其分别通过转化前述N-uricase-pET42 和表达载体而获得。
[0098] 在本发明的一些实施例中，制备了一些感受态细胞以利于体外载体转入到宿主细 胞中。常用制备感受态细胞包括低温处理，例如16°C。
[0099]本发明中所指的大肠杆菌包括大肠杆菌DH5a和Rossetta等宿主细胞。本发明 所使用的表达载体为原核表达载体pET42a(+)，将重组表达载体转化至宿主细胞，利用合适 的条件筛选重组子，诱导表达尿酸酶重组蛋白。本发明中所指的诱导剂为异丙基-3-D-硫 代批喃半乳糖苷（Isopropyl0-D-l-Thiogalactopyranoside，IPTG)。所述的分离纯化方 法包括硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析。
[0100] 本发明主要是尿酸酶重组蛋白的生产工艺，由以下步骤实现：
[0101] 1、产朊假丝酵母尿酸酶基因是已知的（NCBI登陆号为D32043. 1 ;蛋白号为 BAA06804. 1)，编码的尿酸酶全长303个氨基酸残基，通过设计特异性引物，从产朊假丝酵 母基因组DNA中扩增得到尿酸酶的编码序列。
[0102] 2、本发明的一个目的是对编码产朊假丝酵母尿酸酶的DNA序列进行密码子优化， 以实现该序列在大肠杆菌中高效表达。用PCR的方法从产朊假丝酵母尿酸酶基因组中扩增 编码尿酸酶的DNA序列；使用密码子优化软件（http://www.jcat.de/)对尿酸酶的DNA编 码序列进行优化，使其适合于在大肠杆菌中表达。
[0103] 3、基因克隆方法：选用pET42载体，使用Ndel和Hindlll酶切位点将编码产朊 假丝酵母天然尿酸酶的DNA序列和经过密码子优化后的重组尿酸酶DNA编码序列克隆至 pET42载体中，分别得到N-uricase_pET42和R-Uricase_pET42表达质粒；在构建表达质粒 时，利用Ndel识别序列内ATG作为起始密码子，使所表达的蛋白序列与野生型蛋白完全一 致。
[0104] 4、选用大肠杆菌Rossetta菌株作为宿主菌，使外源性的产朊假丝酵母尿酸酶基 因在大肠杆菌中高效表达。
[0105] 5、纯化工艺：本方法表达的尿酸酶不带任何的标签，在纯化时，组合使用硫酸铵分 级沉淀、阴离子交换和凝胶过滤层析，得到纯度达98%以上的重组尿酸酶蛋白。
[0106] 6、重组尿酸酶活性测定：用此工艺纯化所得到的尿酸酶，比活可以达到37. 89U/ mg〇
[0107] 在本发明的一个优选的实施例中，在合适的条件下发酵培养工程菌的步骤包括：
[0108] 取50ii1大肠杆菌Rossetta感受态细胞，放于冰上融化，分别将N-uricase_pET42 和R-Uricase-pET42表达质粒1ill转化至50iil感受态细胞中，冰上放置60min，42°C水 浴热激90S，然后在冰上放置3min。在感受态细胞中加入500ill不含抗生素的LB培养基， 37°C、250r/min震荡培养lh，然后取出80iil产物涂布于含有卡那霉素的固体LB培养板 上，37°C温箱中培养过夜，次日从平板上挑选单菌落，接种于25mlLB培养基（含25mg/ml 卡那霉素），37°C、250r/min振荡培养过夜。次日取50ml过夜培养物转接于1LLB培养基 (含25mg/ml卡那霉素）中，37°C、250r/min培养至0D6QQ至0? 6,加入IPTG使其终浓度为 0.lmmol/L，37°C继续振荡培养12h，离心收集菌体，并取样进行上清可溶性鉴定。
[0109] 在本发明的一个优选的实施例中，从发酵产物中纯化分离尿酸酶重组蛋白包括以 下步骤：
[0110] 1.取发酵培养后收集的大肠杆菌菌体，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤菌体3次；
[0111] 2.每克湿菌体加10倍体积的裂解液重悬，加入终浓度为lmg/ml的溶菌酶和 lmmol/L的DIT和PMSF，冰上作用 30min;
[0112] 3?在冰浴上超声破菌（工作6s、冷却9s、功率为700W、90min)，之后14000r/min、 4°C离心60min，收集上清液。
[0113] 4.硫酸铵分级沉淀：将上清进行硫酸铵分级沉淀，首先在上清液中加入固体硫 酸铵粉末，边加边搅拌，使硫酸铵饱和度达到40%，4°C、20000r/min离心45min，收集上清 液，然后再加入固有硫酸铵，使其饱和度达到60%，室温搅拌30min，4°C、20000r/min离心 45min,收集沉淀物。。
[0114] 5.离子交换层析：将硫酸铵沉淀物溶解于50mmol/L甘氨酸缓冲液（pH10.0)中， 用SephadexG25进行脱盐，将脱盐后的样品上至ResourceQ阴离子交换柱上，用含有1M NaCl的50mmol/L甘氨酸缓冲液（pH10.0)进行线性梯度洗脱，收集含有重组尿酸酶的洗脱 液。
[0115] 6.分子筛纯化：将离子交换后得到的含有重组尿酸酶的组分进行合并，用蛋白浓 缩管浓缩至适当的体积，上样至Superdex75柱，进行分子筛纯化，收集含有重组尿酸酶的 洗脱液。
[0116] 7.收集含有目标蛋白的组分，用SDS-PAGE进行检测，合并纯度达到要求的组分， 浓缩至一定体积后用BCA法测定蛋白浓度，分装至冻存管中，经液氮预冻后，冻存于-80°C 备用。
[0117] 本方法具有如下的优点和效果：1.本方法具有操作简便、成本低廉等优点；本方 法可以得到产量大且纯度高达98%的尿酸酶可溶重组蛋白；本方法获得的重组蛋白具有 很好的体外生物学活性。
[0118] 实施例
[0119] 实施例1产朊假丝酵母尿酸酶的克隆与表达
[0120] 1、产朊假丝酵母基因组DNA的提取：将冻干产朊假丝酵母（2.0120)菌株按说明 书要求复苏后，接种入YH)培养（酵母提取物5g、蛋白胨10g，葡萄糖10g，加水至500ml，调 PH6.0)中，于30°C摇瓶培养，经连续两代培养可见产朊假丝酵母正常生长。离心收集菌体， 用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
[0121] 2、目的基因的扩增：根据GenBank中产朊假丝酵母尿酸酶的基因序列，设计合成 一对引物（上海生工生物工程技术服务有限公司合成），引物中引入NdeI、HindIII酶切位 点。
[0122] P1 :5' -ggA ATT CCA TAT gTC AAC AAC gCT CTC ATC-3'
[0123] P2 :5, -CCC AAg CTT ACA ACT Tgg TCT TCT CC-3，
[0124] 以产朊假丝酵母基因组DNA为模板、如SEQIDNo. 1所示的PI(图1)和SEQID No. 2(图2)所示的P2为引物PCR扩增编码尿酸酶的DNA序列。PCR条件为：94°C预变性 5!^11;941：3〇8,551：3〇8,721：9〇8,35个循环；721：后延伸1〇111111。将扩增产物进行琼脂糖 凝胶电泳，扩增得到912bp的如SEQIDNo. 4所示尿酸酶的氨基酸序列的SEQIDNo. 3所 示编码核苷酸序列（图3和图4)。
[0125] 3、尿酸酶基因改造：基于野生型产朊假丝酵母尿酸酶的基因序列，用密码子优化 软件（ http://www.jcat.de/)对尿酸酶的DNA编码序列进行优化，如SEQIDN0. 5所示的 序列（图5)，由上海生工合成全序列。由其演绎的尿酸酶的氨基酸序列如SEQIDNO. 6所 示（图6)。
[0126] 3、重组质粒的构建及鉴定：将野生型产朊假丝酵母尿酸酶的基因和优化后的序列 与原核表达质粒pET42a(+)(图7)分别用NdeI、HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯 化回收。经T4DNA连接酶连接过夜，转化E.coliDH5a感受态细胞，涂布于含卡那霉素的 LB培养板上，37°C培养过夜。挑取单克隆扩增后提取重组质粒进行NdeI、HindIII双酶切 和PCR鉴定，结果显示含有912bp目的基因片段（图8)，得到野生型产朊假丝酵母尿酸酶的 基因质粒N-Uricase-pET42和序列优化后的重组质粒R-Uricase-pET42,经测序确认，两种 表达质粒构建完全正确。
[0127] 4、目的基因的诱导表达：用重组质粒N-Uricase_pET42和R-Uricase_pET42分别 转化大肠杆菌Rossetta菌株，提取质粒、酶切鉴定。挑取单克隆接种于含卡那霉素（50mg/ L)的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，按1%比例接种新鲜LB培养基，37°C振荡培养至对 数生长期，加入IPTG至终浓度0.lmmol/L诱导表达，于诱导前、诱导后1. 5h、3h、5h、7h分别 取300ill菌液，离心后取菌体进行SDS-PAGE，检测目的蛋白表达情况，确定最佳诱导时间。 大量培养后，收集菌体、超声破碎，分别取超声上清和沉淀进行SDS-PAGE鉴定，确定目的蛋 白是否为可溶性表达。菌体经SDS-PAGE检测，在约34kD处有一明显的蛋白表达条带，与从 其基因序列推测的303个氨基酸的理论相对分子质量34kD相符，证明重组尿酸酶基因工程 菌构建成功（图9)。同时，随着诱导时间的延长，目的蛋白表达量增多，到诱导后8h达到峰 值。收集大量诱导培养的菌体，超声破菌后将全菌、超声上清和沉淀进行SDS-PAGE，在全菌 和破菌上清中，有一条分子质量约34kD的高表达蛋白条带，说明目的蛋白在大肠杆菌中成 功表达，表达量占细菌总可溶性蛋白的50%以上，且以可溶的形式存在。
[0128] 实施例2重组尿酸酶的纯化与鉴定
[0129]目的蛋白的纯化：将诱导后的菌液5000r/min、4°C离心20min，收集菌体，然后用 PBS(pH7. 4)洗两遍，菌体沉淀再用PBS重悬，超声破碎菌体（整个过程均在冰浴中进行）， 1200〇1'/111；[11、41€离心45111；[11，收集上清 ；将上清进行硫酸铵分级沉淀，主要在40%?60% 硫酸铵饱和度组分中含有重组尿酸酶蛋白，收集此组分的沉淀，溶解于50mmol/L甘氨酸缓 冲液（PH10. 0)中，用S印hadexG25进行脱盐，然后用ResourceQ阴离子交换柱纯化（图 10)，收集含有重组尿酸酶的洗脱液，用Superdex75柱进行分子筛纯化（图11)，收集含有 重组尿酸酶的洗脱液，进行SDS-PAGE分析，合并含尿酸酶蛋白的组分，浓缩至适当的体积， 用BCA法测定蛋白含量，分装后-80°C保存。
[0130] 整个纯化过程中的SDS-PAGE检测如图6所示，纯化过程中各步骤的活性检测如表 1所示。从表1可以看出，序列经过优化后，表达的尿酸酶的总活性提高4. 82%，经过一系 列纯化后，优化后序列得到的目的蛋白的总活性提高11. 4%。
[0131] 1.表达蛋白的质谱鉴定及数据库检索：将纯化的蛋白样品经过质谱鉴定（图13)， 经NCBI数据库分析，证实确为产朊假丝酵母尿酸酶。
[0132] 实施例3重组尿酸酶的活性测定
[0133] 活性分析：采用Legoux等（1992)报道的方法。每分钟将1iimol尿酸氧化为尿囊 素所需的酶量为酶活性的1个国际单位（IU)。在5ml的反应体系中，分别加入3ml三乙醇 胺缓冲液（pH8.9)、1.5ml0. 2iimol/L尿酸贮存液、lygdOiil)纯化的尿酸酶，30°C反应 5min，然后加入0. 5ml20%的K0H终止反应，测定尿酸浓度，检测波长为292nm。
[0134] 根据标准曲线计算酶的活性，从野生型产朊假丝酵母尿酸酶的基因和优化后的序 列表达的重组尿酸酶活性没有差别，比活分别为36.lU/mg和37. 9U/mg。
[0135] 上述结果归纳为表1。
[0136] 表1重组尿酸酶各纯化步骤的活性及蛋白含量检测（1L工程菌发酵液）
[0137]
【权利要求】
1. 一种产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白，其特征在于，所述尿酸酶重组蛋白包含任一如 下氨基酸序列或与其具有85%以上同一性的氨基酸序列： a) SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列；或 b) SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
2. 分尚的核酸分子，其特征在于，所述分尚的核酸分子包含任一如下核苷酸序列或与 其具有50%以上同一'丨生的核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或 b) 与SEQ ID NO. 2所示的反义核苷酸序列；或 c) 编码SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 d) 编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
3. -种产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白，其特征在于，所述产朊假丝酵母尿酸酶重组 蛋白通过表达任一以下所示的核苷酸序列或与其具有50%以上同一性的核苷酸序列而获 得： a) 编码SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 b) 编码SEQ ID N0:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
4. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有任一以下所示的核苷酸序列或与其 具有50%以上同一'丨生的核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或 b) 与SEQ ID NO. 2所示的反义核苷酸序列；或 c) SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 d) SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
5. 如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET42a (+)。
6. -种工程细胞，其特征在于，所述工程细胞是通过转化权利要求4或5所述的表达载 体进入宿主细胞后获得的细菌细胞。
7. 如权利要求5所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞为大肠杆菌DH5 a or Rossetta细胞，优选为Rossetta细胞。
8. -种制备产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括： a) 将权利要求3所述的任一核苷酸序列克隆入表达载体pET42a(+)的步骤； b) 将所述表达载体pET42a(+)转入到宿主细胞大肠杆菌Rossetta感受态细胞的步 骤； c) 将宿主细胞大肠杆菌Rossetta细胞进行培养步骤，培养条件包括：培养分为培养阶 段和诱导阶段，在培养阶段，首先挑选单菌落接种于25ml含25mg/ml卡那霉素的LB培养 基，37°C振荡培养过夜，次日取50ml过夜培养物转接于含25mg/ml卡那霉素的1L LB培养基 中，37°C培养至0D6(i(i至0. 6后加入IPTG，使之终浓度为0. lmmol/L，37°C继续振荡培养12h， 离心收集菌体； d) 通过盐析进行初步纯化步骤，所述盐析为硫酸铵分级沉淀，用40-60%中性硫酸铵 进行分级粗提蛋白； e) 通过阴离子交换、凝胶过滤步骤，所述阴离子交换层析使用Resource Q柱；所述凝 胶过滤使用Superdex75 10/60Hiload柱，最终所得目的蛋白的纯度在96%以上的产朊假 丝酵母尿酸酶重组蛋白的步骤。
9. 产朊假丝酵母尿酸酶重组蛋白在制备治疗与人体高尿酸相关疾病或病理症状的药 物、食品、保健品及其化妆品中的用途。
10. 如权利要求8所述的方法或权利要求10所述的用途，其特征在于，所述尿酸酶重组 蛋白包含任一如下氨基酸序列或与其具有85%以上同一性的氨基酸序列： a) SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列；或 b) SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
【文档编号】C12N15/70GK104342415SQ201410535887
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月12日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】李慎涛, 庞海, 刘爽 申请人:吉林省金梓源生物科技有限公司