一种高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种蛋白酶的提取纯化方法，属于生物【技术领域】。本发明所述的一种高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，包括下述步骤：a.新鲜木瓜割浆，按其质量比1：1-0.5加入水，搅拌混匀后得到浆液；c.将浆液离心分离，分离出上清液，并得到木瓜浆残渣；d.木瓜浆残渣按质量比1：1加入水，搅拌均匀后用胶体磨打磨乳化，乳化液离心分离，取上清液与步骤c获得的上清液混合e.将混合液先微滤，再超滤，最后经冷冻干燥后粉碎即可。本发明在胶体磨前先进行固液分离，极大减少处理量，有效降低打磨过程中的温度，在提高提取率的同时有效保证蛋白酶的酶活性。
【专利说明】一种高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蛋白酶的提取纯化方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]木瓜蛋白酶广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟果实的乳汁中含量最是丰富。木瓜蛋白酶具有适用温度、酸碱度范围广、反应活性强、产品稳定性好等特征，因此在医药、食品、饮料、化学试剂、饲料、纺织化妆品等方面都有广泛的应用，是植物蛋白酶类产品中使用量和使用领域最大最广泛的酶之一。
[0003]目前提取木瓜蛋白酶的方法较多，如超滤法、盐析法、有机溶剂法、亲和层析法等。盐析法设备要求低、操作简单，但产品杂质尤其是盐含量偏高，产品活性较低，无法在有较高活力和纯度要求的领域应用，如医药；有机溶剂法存在工艺复杂、物料消耗大和溶剂残留高的问题；亲和层析法能获得较高纯度和活性的木瓜蛋白酶产品，但设备要求高，同时难以大规模工业生产。因此，当前的主流生产工艺为超滤法，该法设备要求高，但工艺简单、不会引进别的化学物质，产品活性好、纯度高。
[0004]超滤法的一般工艺流程为:木瓜乳汁一胶体磨磨浆一固液分离一微滤一超滤一冻干一粉碎包装。利用此法能获得酶活为250万U/g左右的木瓜蛋白酶产品。但该法存在两方面的缺陷，第一，由于胶体磨本身的特点，在工业生产处理大量原料时，容易造成料液温度过高，极大影响产品的酶活；第二，在微滤之后采用单分子量截留超滤，实际上去除的只是小分子盐和少部分有机杂质，起到的总效果仅仅和浓缩相当。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，它在提高提取率的同时还能保证蛋白酶的酶活性。
[0006]胶体磨处理木瓜浆降低酶活是因为处理量大，长时间工作造成料液温度过高而引起的，本发明第一步就进行固液分离，得到的固相再进入胶体磨，这样，由于处理量小温度不会升的过高，同时液相部分不用进入胶体磨，本身酶活性保持较好，胶体磨负荷极大降低。
[0007]本发明所述的一种高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，包括下述步骤:
a.新鲜木瓜割浆，按其质量比1:1-0.5加入水，搅拌混匀后得到浆液；
c.将浆液离心分离，分离出上清液，并得到木瓜浆残渣；
d.木瓜浆残渣按质量比1:1加入水，搅拌均匀后用胶体磨打磨乳化，乳化液离心分离，取上清液与步骤C获得的上清液混合
e.将混合液先微滤，再超滤，最后经冷冻干燥后粉碎即可。
[0008]优选地，步骤c在离心分离前先对浆液进行打浆。
[0009]所述的打浆是指将浆液粉碎搅拌均匀，其中粉碎可以用目前任意粉碎机将上述的加水木瓜浆粉碎，达到打细就可以。其中粗细没有严格限制。
[0010]或者优选地，步骤a和步骤c之间还有步骤
b.向浆液中添加抑菌剂、还原剂和金属离子鳌合剂。
[0011]或者优选地，步骤e所述的微滤是指采用0.2微米陶瓷膜进行微滤。
[0012]或者优选地，步骤e所述的超滤是指先经过50KDa中空纤维超滤膜进行一次超滤，再经过5KDa中空纤维超滤膜进行二次超滤。
[0013]本发明在胶体磨前先进行固液分离，只有固相进入胶体磨，极大减少处理量，有效降低打磨过程中的温度，在提高提取率的同时有效保证蛋白酶的酶活性。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
1.先对原料打浆处理，离心分离后，上清液中活性收率为70%左右；
2.上述离心处理的固相残渣，质量为原料质量的23%左右，胶体磨处理时，负荷减少约80%，处理液温度能较好控制，从而减少高温造成的酶活下降；
3.采用胶体磨处理的残渣经加水、搅拌后离心分离,产品酶活占原料总酶活24%以上，因此采用该工艺，膜处理之前，原料中酶活总提取率约为94% ；
4.微滤采用0.22微米陶瓷膜，初步去除较大杂质，使后续超滤工艺更高效；
5.超滤采用两级处理，总收率在95%以上:
50KDa超滤步骤，一方面完全去除水体中的微生物，保证产品的微生物指标完全满足相关标准，另一方面，截留高于其截留分子量的生物大分子，包括多糖、核酸和杂质蛋白；
5KDa超滤步骤则能去除小分子杂质，包括寡糖、寡肽、氨基酸等和无机盐类，同时通过这一步的浓缩特性，后续冻干步骤地负荷也能极大减小；
6.最终产品酶活在330万U/g以上，总收率约为85%。
【具体实施方式】
[0015]实施例一
a.新鲜木瓜割衆，向100公斤衆中加入80公斤水,得到衆液；
b.向浆液中添加抑菌剂、还原剂和金属离子鳌合剂；
c.打浆搅拌后离心分离，分离出159公斤上清液，得到21公斤木瓜浆残渣；
d.木瓜浆残渣中加入20公斤水，搅拌均匀后用胶体磨打磨乳化，乳化液离心分离，得到25公斤上清液，将其与步骤c获得的上清液混合均匀；
e.将混合液先过0.2微米陶瓷膜微滤，再经过50KDa中空纤维超滤膜一次超滤，5KDa中空纤维超滤膜二次超滤，最后经冷冻干燥后粉碎即得到4.4公斤木瓜蛋白酶；
f.经检测，木瓜蛋白酶的活力为:327.7万U/g。
[0016]实施例二
a.新鲜木瓜割衆，向100公斤衆中加入100公斤水,得到衆液；
b.向浆液中添加抑菌剂、还原剂和金属离子鳌合剂；
c.离心分离，分离出176公斤上清液，得到24公斤木瓜浆残渣；
d.木瓜浆残渣中加入21公斤水，搅拌均匀后用胶体磨打磨乳化，乳化液离心分离，得到27公斤上清液，将其与步骤c获得的上清液混合均匀；
e.将混合液先过0.2微米陶瓷膜微滤，再经过50KDa中空纤维超滤膜一次超滤，5KDa中空纤维超滤膜二次超滤，最后经冷冻干燥后粉碎即得到5.4公斤木瓜蛋白酶；f.经检测，木瓜蛋白酶的活力为:296.7万U/g。
【权利要求】
1.一种高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，其特征在于包括下述步骤: a.新鲜木瓜割浆，按其质量比1:1-0.5加入水，搅拌混匀后得到浆液； c.将浆液离心分离，分离出上清液，并得到木瓜浆残渣； d.木瓜浆残渣按质量比1:1加入水，搅拌均匀后用胶体磨打磨乳化，乳化液离心分离，取上清液与步骤c获得的上清液混合； e.将混合液先微滤，再超滤，最后经冷冻干燥后粉碎即可。
2.如权利要求1所述的高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，其特征在于步骤c在离心分离前先对浆液进行打浆。
3.如权利要求1所述的高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，其特征在于步骤a和步骤c之间还有步骤 b.向浆液中添加抑菌剂、还原剂和金属离子鳌合剂。
4.如权利要求1所述的高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，其特征在于步骤e所述的微滤是指采用0.2微米陶瓷膜进行微滤。
5.如权利要求1或2所述的高效提取无菌木瓜蛋白酶的方法，其特征在于步骤e所述的超滤是指先经过50KDa中空纤维超滤膜进行一次超滤，再经过5KDa中空纤维超滤膜进行二次超滤。
【文档编号】C12N9/50GK104293750SQ201410544148
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】杨刚柱, 徐小琴, 苌钊, 张卫刚, 阎岩, 杨立琛 申请人:重庆骄王天然产物股份有限公司