一株hiv-1 crf01_ae亚型毒株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株HIV-1CRF01_AE亚型毒株及其应用。本发明公开的一株人类免疫缺陷病毒Ⅰ型CRF01_AE亚型(Human Immunodeficiency Virus Type Ⅰ subtype CRF01_AE)病毒，其保藏号为CGMCC No.8787。本发明公开的HIV-1CRF01_AE亚型临床分离株GX002可广泛应用于治疗艾滋病药物的筛选，以及HIV-1复制能力相关研究，进而对艾滋病的防治研究具有重要的应用价值和意义。
CGMCC No.8787
2014.02.18
【专利说明】-株HIV-1CRF01_AE亚型毒株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株Hiv-1CRF01_AE亚型毒株及其应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 由人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的人类获得性 免疫缺陷综合征（Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)自1985年传入中国以来， 在中国的传播范围逐渐增大，传播速率越来越快。其流行先后经历了传入期和扩散期，目前 进入快速增长期。根据中国性病艾滋病预防控制中心2014年第一季度的疫情报告，截至 2014年3月31日，全国报告现存或HIV/AIDS455352例，死亡140750例，现存活HIV感染 者275631例，AIDS病人179721例。性传播成为主要的传播途径，占全部感染的大约90% (包括异性和同性）。中国政府对艾滋病防治高度重视，"十一五"起实施了艾滋病及病毒性 肝炎等传染病防治科技重大专项，在项目的支持下，艾滋病诊断试剂、疫苗和其他生物预防 产品的研发正在快速推进。
[0003]HIV具有高度的变异性，这导致了HIV-1的多样性，不仅表现在其基于病毒基因碱 基的组成和排列而区分出的繁多的亚型，更表现为即使是同亚型的病毒，其感染能力、复制 能力和对环境的适应能力也大相径庭，这也导致了病毒在毒力上具有很大差别。而这些将 对艾滋病诊断试剂、疫苗和抗HIV-1药物的研发和筛选产生深远影响。
[0004] 病毒的毒力是指病毒感染宿主后能引起终末器官损伤的能力，体现为未经治疗的 感染发展为艾滋病的速率。作为影响病毒毒力的主要因素之一，病毒的复制能力表现为在 宿主细胞内病毒颗粒增加的效率。对于抗HIV药物来说，对临床分离毒株复制能力的抑制， 是评价药物药效的重要标准之一；对于我国HIV-1复制能力相关研究来说，也需要一株高 复制能力的病毒毒株作为标准参考毒株来进行系统完善的比对分析。
[0005] 国家食品药品监督管理局药品审评中心（简称"国家药监局药审中心"）要求，评 价抗HIV药物药效必须采用三种病毒（实验株、临床分离株、耐药株）进行体外实验。目前 为止还没有应用于艾滋病新药评价的高复制能力的标准HIV-1临床分离株，另一方面，我 国的HIV-1复制能力相关研究也因缺少高复制能力的标准HIV-1临床分离株而受到制约。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一株HIV_1CRF01_AE亚型毒株及其应用，本发明提供的 HIV-1CRF01_AE亚型临床分离株GX002可以应用于治疗艾滋病药物的筛选，以及HIV-1复制 能力相关研究。
[0007] 本发明提供一株人类免疫缺陷病毒I型CRF01_AE亚型（HumanImmunodeficiency VirusTypeIsubtypeCRF01_AE)病毒，其保藏号为CGMCCNo. 8787;
[0008] 所述病毒的全基因组序列如SEQIDNo.7所示；
[0009] 所述病毒为具有高复制能力的人类免疫缺陷病毒I型CRF01_AE亚型病毒。
[0010] 一种评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的试剂盒也属于本发明的保护 范围，该试剂盒包含上述病毒。
[0011] 一种评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的方法也属于本发明的保护范 围，包括如下步骤：
[0012] ⑴测定药物对宿主细胞的半数中毒浓度，记作TC5Q ;
[0013] (2)测定药物在宿主细胞/HIV-1GX002系统的抗病毒活性，得到药物对病毒 HIV-1GX002的半数抑制浓度，记作IC5Q ;
[0014] (3)将步骤⑴得到的TC5Q和步骤⑵得到的IC5Q，带入公式TI=TC5Q/IC5Q，计算 得到药物的治疗指数TI;
[0015] 所述宿主细胞/HIV-1GX002系统中所述HIV-1GX002可以在所述宿主细胞中进行 复制；
[0016] 所述HIV-1GX002为上述病毒。
[0017] 上述方法中，所述宿主细胞为具有辅助受体CCR5或CXCR4的细胞，具体为离体的 人外周血单核细胞。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述步骤（1)的测定方法为MTT法；
[0019] 所述步骤（2)中的IC5Q是通过测定药物在宿主细胞/HIV-1GX002系统的抗病毒活 性的细胞病变效应观察法得到或通过检测HIV-1P24抗原得到；
[0020] 所述检测HIV-1P24抗原所采用的试剂盒的商品名称为HIV-1P24抗原检测试剂 盒，该试剂盒购自河北医科大学生物医学工程中心。
[0021] 上述病毒在制备评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的产品中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0022] 上述病毒在制备筛选对HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的产品中的应用也属 于本发明的保护范围。
[0023] 上述试剂盒在制备评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的产品中的应用 也属于本发明的保护范围。
[0024] 上述试剂盒在制备筛选对HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的产品中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0025] 上述病毒或上述试剂盒在制备筛选和/或评价药物在预防和/或治疗HIV-1病毒 引起的疾病的效果的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0026] 本发明提供的HIV_1CRF01_AE亚型临床分离株GX002对艾滋病的防治研究具有 重要的应用价值和意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为以P24抗原浓度为指标测定的HIV-1毒株在人外周血单核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)上的生长动力学曲线图。
[0028] 图2为以逆转录酶RT浓度为指标测定的HIV-1毒株在PBMCs上的生长动力学曲 线图。
[0029] 图3为GX002前病毒DNA的5 '半分子和3 '半分子PCR扩增产物电泳图。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]HIST0PAQUE-1077 购自SIGMA，产品目录号为 10771。
[0033]HIV-1P24抗原检测试剂盒购自河北医科大学生物医学工程中心。
[0034]QIAampDNAMiniKit购自德国QiaGen公司，产品目录号为51306。
[0035]实施例中表 1 所示引物在参考文献"YongjianLiu,LinLi,ShaominYang,Zuoyi Bao,HanpingLi，ZhengWang,DaominZhuang,SiyangLiu,LiliChen,YishanFan,Min Zhong，LiGao,XiaolinWang,andJingyunLi:IdentificationandCharacterization ofTwoNewHIVTypelUnique(B/C)RecombinantFormsinChina.AIDSResHum Retroviruses. 20llApr;27 (4) : 445-51. " 中公开过。
[0036]pNL4. 3 质粒在文献"WangC，MitsuyaY，GharizadehB，Ronaghi M，ShaferRW.Characterizationofmutationspectrawithultra-deep pyrosequencing:applicationtoHlV-ldrugresistance.GenomeRes.2007 ； 17 (8) : 1195-201.；HoffmannC,MinkahN,LeipzigJ,WangG,ArensMQ,TebasP,Bushman FD.NAbarcodingandpyrosequencingtoidentifyrareHIVdrugresistance mutations.NucleicAcidsRes. 2007 ;35 (13) :e91. "中公开过，公众可从中国人民解放军 军事医学科学院微生物流行病研究所获得。PNL4. 3质粒含有HIV-1B亚型野生株的全基因 组序列，转染细胞并表达可以得到HIV-1B亚型野生株NL4-3。
[0037]Lipofectamine2000 购自Invitrogen公司。
[0038]NL4-3病毒由pNL4. 3质粒转染293T细胞表达获得。该病毒的制备过程如下：用 DMEM培养基（含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素）重悬293T细胞，得到4X105个细 胞/ml的细胞悬液。将细胞悬液加入6孔培养板，每孔2ml，在C02培养箱中37°C培养24小 时，然后弃除上清，用PBS缓冲液洗绦两次。按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，将质 粒pNL4. 3转染293T细胞，每孔转染4微克pNL4. 3,在C02培养箱中37°C培养36小时，收 集上清，将上清用HIV-1P24抗原检测试剂盒进行P24抗原测定，结果为阳性，该上清即为 HIV-1B亚型野生株NL4-3病毒液，分装后-80°C保存。
[0039]HIV-1B亚型参考毒株IIIB_LAI病毒在文献"MontagnierLuc，Krust Bernard,ChamaretSolange,ClavelFrancois,ChermannJeanClaude,BarreSinoussi Francoise，A1izonMarc,SonigoPierre,StewartCole,DanosOlivier,Wain HobsonSimon:Envelopeantigensoflymphadenopathyassociatedvirusand theirapplications.PasteurInstitut，CentreNatRechScientNovember 20, 1986:EP0201540-A1. "中公开过，公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流 行病研究所获得。
[0040]HIV-lThai-B亚型参考毒株CNHN24 在文献"WangZ,WangSX,LiuSY,Bao ZY,ZhuangDM,LiL,ZhangCH,ZhangL,LiJY,Lu:ImmunogenicitiesofEnv glycoproteinsfromcirculatingHIV-lisolatesinChinafocusingonthestrategy of"DNAprimeplusproteinboost".ChinMedJ(Engl). 20090ct5 ; 122 (19):2339-45?"中 公开过，公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
[0041] 培养PBMCs所用的细胞培养液组成如下：含有体积百分含量10%的胎牛血清， lOOIU/ml青霉素，100iig/ml链霉素和lOIU/ml的白介素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培养基。
[0042] Reverse Transcriptase Assay, colorimetric 购自 Roche，产品目录号为 11468120910。
[0043] 培养MT-4和H9细胞系所用的细胞培养液组成如下：含有体积百分含量为10%的 胎牛血清，100IU/ml青霉素，100iig/ml链霉素的RPMI1640培养基。
[0044] 逆转录酶抑制剂齐多夫定（Zidovudine,AZT)购自SIGMA公司，产品目录号为 A2169。
[0045] 蛋白酶抑制剂沙奎那韦（Saquinavir，SQV)购自上海迪赛诺生物医药有限公司。
[0046]MTT购自SIGMA公司，使用时用PBS配制成5mg/ml的溶液，0. 45um膜过滤备用。
[0047]HIV-13TC耐药株在文献"李珏，鲍作义，刘思扬，庄道民，李韩平，刘永建，李 林，杨坤，李敬云.HIV拉米夫定（3TC)耐药毒株的体外诱导培育和鉴定.中华微生物和 免疫学杂志.2006 ;26 (3) : 220-223. "中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院 微生物流行病研究所获得，该耐药株的pol基因发生M184I突变，对拉米夫定（Lamivudine) (又名 3TC(2' -3'deoxy-3' -thiocytidine))的IC5(I 是 0? 018iig/ml，为HIV-lThai-B亚 型参考毒株CNHN24的113777倍。
[0048] MT-4 细胞（传代人 T 淋巴细胞系）在文献"Harada S, YamamotoN. Quantitative analysis of AIDS-related virus-carrying cells by plaque-forming assay using an HTLV-I-positive MT_4cell line. Jpn J Cancer Res. 1985Jun;76(6):432_5." 中公开 过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
[0049]H9细胞（HIV慢性感染T淋巴细胞系）在文献"PyleSW1，BessJW，JrRobey WG,FischingerPJ,GildenRV,ArthurL0.Purificationof120000daltonenvelope glycoproteinfromculturefluidsofhumanimmunodeficiencyvirus(HIV)-infected H9cells.AIDSResHumRetroviruses. 1987;3(4):387_400?"中公开过，公众可从中国人 民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
[0050]人外周血单核细胞（Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)米自多人份 的HIV抗体阴性健康人，5iig/ml植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA)活化3天后使用， 用体积百分含量为10%的胎牛血清，l〇〇IU/ml青霉素，100yg/ml链霉素和10IU/ml的白介 素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培养基培养和传代。
[0051] 实施例中的GX2005002和GX002是同一种病毒株，即保藏号为CGMCCNo. 8787的 病毒株。
[0052] 实施例1、GX002的分离、培养及全长基因组序列的测定
[0053] 一、高复制能力HIV-1CRF01_AE亚型毒株GX002的分离与传代培养
[0054]( -）将中国广西壮族自治区某艾滋病人体内获得的全血以250g离心8分钟，使 血浆和血细胞分离，弃上层血浆，将下层的血细胞吸入50ml规格的离心管，加入与血浆等 体积的生理盐水稀释混匀，得到稀释后的血细胞悬液；
[0055](二）向另一新的离心管中按体积比为1:1的比例缓慢先后加入分离液 HIST0PAQUE-1077和稀释后的血细胞，加入稀释后血细胞时用移液管靠壁缓慢加入，使稀释 后的血细胞悬液和分离液之间形成明显的分离液面；
[0056](三）将步骤（二）的离心管以400g离心30分钟后，液面被分为颜色和浓度不同 的四层，所需的人外周血单核细胞（PBMCs)就在从上至下第二层的白色层中；
[0057](四）将最上面一层液面吸除，尽可能多地收集白色层中的细胞悬液进新的离心 管，用30ml的生理盐水洗细胞三次，最后一次将分离出的病人体内的PBMCs，用含体积百分 含量10%的胎牛血清（FBS)，100IU/ml的青霉素和100yg/ml的链霉素的RPMI1640培养基 重悬至1〇6个细胞/ml，将其与分离于健康供血者血浆的人外周血单核细胞（PBMCs)按数量 比1:1的比例在6孔板中共培养28天，每7天取100ul细胞培养上清（从细胞培养板每孔 中吸取120ul细胞培养液（尽量少吸到底层的细胞）然后250g离心10分钟）进行P24抗 原浓度检测（以下P24抗原浓度的检测均用HIV-1P24抗原检测试剂盒测定），以观察病毒 的生长情况，并用分离于健康供血者血液的人外周血单核细胞（PBMCs)替换孔中1/2原来 的细胞；
[0058](五）培养28天后，每孔吸取1ml培养上清接种于10ml规格细胞培养瓶中培养7 天，测定其培养上清液中的P24抗原浓度，收取上清液，分装入lml规格的冻存管，置于液氮 中冻存；
[0059](六）将冻存后的lml上清液接种于50ml规格细胞培养瓶中用含有体积 百分含量10 %的胎牛血清，l〇〇IU/ml青霉素，100yg/ml链霉素和10IU/ml的白介 素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培养基扩大培养，7天后测定培养上清液中的P24含 量，收取上清液，得到各分离株，分别分装入lml规格的冻存管，置于液氮中冻存。
[0060] 二、高复制能力HIV-1CRF01_AE亚型毒株GX002的生长动力学曲线的制作 [0061]分别取含lngP24抗原的各病毒培养上清（经步骤一分离和扩大培养后所得）， 将其稀释于〇. 6ml细胞培养液（含有体积百分含量10%的胎牛血清，100IU/ml青霉素， 10〇1^/1111链霉素和10几/1111的白介素-2(11^61'16111^11，11-2)的1^]\01640 培养基）中 接种于24孔板（预先在24孔板上设有每孔1. 8ml浓度为106个细胞/ml的健康供血者的 人外周血单核细胞（PBMCs)重悬液），连续培养18天，每48小时取100ill各病毒培养上 清液测定P24抗原浓度，再取lml的病毒培养上清液，高速离心富集病毒颗粒，用Reverse TranscriptaseAssay,colorimetric测定逆转录酶RT的浓度。以感染后时间为横坐标，分 别以P24抗原浓度和逆转录酶RT浓度为纵坐标绘制生长动力学曲线，分别如图1和图2所 /_J、i〇
[0062] 图 1 和图 2 中，SD2010001、BJ2010002、GX2005002、⑶2005006、⑶2005003 分别代 表步骤一得到的各分离株、CNHN24代表HIV-lThai-B亚型参考毒株CNHN24，IIIB_LAI或IIIB代表HIV-1B亚型参考毒株IIIB_LAI病毒，NL4-3代表NL4-3病毒。
[0063] 并于每次取样时补入1. 2ml培养基（含有体积百分含量10%的胎牛血清，100IU/ ml青霉素，l〇〇yg/ml链霉素和l〇IU/ml的白介素-2(Interleukin，IL-2)的RPMI1640 培 养基），在第7天和第14天取上清后用新鲜的健康供血者的人外周血单核细胞（PBMCs)更 换一半数量的孔中细胞，以维持细胞的生长状态。
[0064] 上述实验中，HIV-1B亚型参考毒株NL4-3和IIIB_LAI病毒，以及HIV-lThai-B亚 型参考毒株CNHN24均为对照。
[0065] 图1表明，步骤一得到的各分离株中，GX2005002病毒的培养上清的P24抗原含量 的峰值最高，GX2005002病毒在PBMCs上培养18天后，GX2005002病毒的培养上清的P24 抗原含量的峰值（25440.OOpg/ml)为对照毒株NL4-3峰值（4208. 32pg/ml)的6. 05倍，为IIIB_LAI峰值（4093. 06pg/ml)的6. 22倍，CNHN24没有成功感染，失去参考价值。
[0066] 图2表明，步骤一得到的各分离株中，GX2005002病毒的培养上清的逆转录 酶RT含量的峰值最高，GX2005002病毒在PBMCs培养上清液中逆转录酶RT含量的峰值 (3390. 50pg/ml)为毒株IIIB_LAI峰值（803. 50pg/ml)的 4. 22 倍，为NL4-3 峰值（507. 5pg/ ml)的6. 68倍，CNHN24没有成功感染细胞，失去参考价值。
[0067] 图1和图2表明，GX2005002病毒为的复制能力较常用的HIV-1B亚型参考毒 株NL4-3和IIIB_LAI病毒的复制能力强，通过分型发现该病毒属于CRF01_AE亚型，所以 GX2005002是拥有较高复制能力的HIV-1CRF01_AE亚型临床分离株。
[0068] 三、GX2005002全长基因组的扩增和测序
[0069] 用QIAampDNAMiniKit试剂盒从GX2005002病毒培养所用的PBMCs中提取前病 毒DNA，进行GX2005002毒株全长基因组测定。
[0070]HIV-1全长基因组的扩增策略是分别扩增GX2005002基因组的两个半分 子-5'half?和3'half，两者之间有约100bp的重叠区域用于连接。对提取所得的前病毒 DNA进行半套式PCR扩增，以得到包含病毒基因组两端长末端重复序列（Longterminal repeat,LTR)在内的全部基因组序列信息。
[0071] 具体步骤如下：
[0072] 第一轮反应：
[0073]以前病毒DNA为模板，以U-LTR5-AE(SEQIDNo. 1)和 07Rev8(SEQIDNo. 2)为引 物进行PCR扩增，得到5'半分子第一轮PCR扩增产物（5219bp);
[0074]以前病毒DNA为模板，以 07For7(SEQIDNo. 3)和D-MluI-AE+BC(SEQIDNo. 4) 为引物进行PCR扩增，得到3'半分子第一轮PCR扩增产物（4817bp);
[0075] 第二轮反应：
[0076] 以5'半分子第一轮PCR扩增产物为模板，以U-LTR5-AE(SEQIDNo. 1)和 Revll(SEQIDNo. 5)为引物进行PCR扩增，得到5'半分子第二轮PCR扩增产物（5066bp);
[0077] 以3'半分子第一轮PCR扩增产物为模板，以VIF1(SEQIDNo. 6)和 D-MluI-AE+BC(SEQIDNo. 4)为引物进行PCR扩增，得到3'半分子第二轮PCR扩增产物 (4792bp)。
[0078] 5'半分子第二轮PCR扩增产物和3'半分子第二轮PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电 泳如图3所示。图3中第5泳道为5'半分子第二轮PCR扩增产物，长度约为5kb;第11泳 道为3'半分子第二轮PCR扩增产物，长度约为4. 8kb;Marker为DNA分子量标准。
[0079] 将5'端半分子和3'端半分子的第二轮PCR扩增产物分别进行测序后，使用 ContigExpress软件拼接序列片段，得到完整的GX2005002毒株全基因组序列，如SEQID No. 7所示。
[0080] 下述实施例中将GX2005002简称为GX002。
[0081] 表1HIV-1CRF01_AE亚型毒株GX002全长基因组序列扩增引物
[0082]
【权利要求】
1. 一株人类免疫缺陷病毒 I 型 CRF01_AE 亚型（Human Immunodeficiency Virus Type I subtype CRF01_AE)病毒，其保藏号为 CGMCC No.8787。
2. -种评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的试剂盒，该试剂盒包含权利要 求1所述的病毒。
3. -种评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的方法，包括如下步骤： (1) 测定药物对宿主细胞的半数中毒浓度，记作TC5(I ; (2) 测定药物在宿主细胞/HIV-1GX002系统的抗病毒活性，得到药物对病毒 HIV-1GX002的半数抑制浓度，记作IC5Q ; (3) 将步骤⑴得到的TC5(I和步骤⑵得到的IC5(I，带入公式TI = TC5(I/IC5(I，计算得到 药物的治疗指数TI ; 所述宿主细胞/HIV-1GX002系统中所述HIV-1GX002可以在所述宿主细胞中进行复 制； 所述HIV-1GX002为权利要求1所述的病毒。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为离体的人外周血单核细 胞。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步骤⑴的测定方法为MTT法； 所述步骤（2)中的IC5Q是通过测定药物在宿主细胞/HIV-1GX002系统的抗病毒活性的 细胞病变效应观察法得到或通过检测HIV-1P24抗原得到。
6. 权利要求1所述的病毒在制备评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的产品 中的应用。
7. 权利要求1所述的病毒在制备筛选对HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的产品中 的应用。
8. 权利要求2所述的试剂盒在制备评价药物对HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的产 品中的应用。
9. 权利要求2所述的试剂盒在制备筛选对HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的产品 中的应用。
10. 权利要求1所述的病毒或权利要求2所述的试剂盒在制备筛选和/或评价药物在 预防和/或治疗HIV-1病毒引起的疾病的效果的产品中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK104328091SQ201410549312
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】韩婧婉, 刘思扬, 庄道民, 李韩平, 梁淑家, 李敬云 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 广西壮族自治区疾病预防控制中心