高纯L-α-氨基酸的生物合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种高纯L-α-氨基酸的生物合成方法，该方法是在反应液中，醛类化合物和甘氨酸原料在L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶的催化作用下进行酶催化反应得到2-酮酸产物；将所得2-酮酸产物在由亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶组成的辅酶催化下进行酶催化反应，反应产物依次经过电渗析脱盐、活性炭脱色、浓缩结晶、真空干燥处理，高产率得到高纯度L-α-氨基酸晶体；该方法以水相为反应体系，环保、廉价，设备要求低、酶可以反复使用，成本低，满足工业化生产。
【专利说明】高纯L- α -氨基酸的生物合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型生物法转化合成L-α -氨基酸及纯化浓缩结晶得到高纯度 L- α -氨基酸的方法，属于生物合成领域。
【背景技术】
[0002] 氨基酸是组成蛋白质的基本物质，是人体生命活动的必需，它在体内担负着合成 肌肉、皮肤、脏器、酶、免疫抗体所必需的成分。一般而言氨基酸分为D型和L型，人体中只 有L型氨基酸才参与代谢，具有生理活性。
[0003] L-正缬氨酸是合成培哚普利、ACE-抑制剂一抗高血压类药物的关键中间体。L-正 缬氨酸可以通过拆分外消旋的DL-正缬氨酸获得，也可以通过直接合成获得，相关的报道 较少。日本专利JP7553587采用发酵法制取，产量约为3. 79g/L，远低于一般发酵生产氨 基酸的产量，难以满足工业化的生产需求。中国专利CN1651400,公开了以正丁醛和丙酮 氰醇为原料合成L-正缬氨酸的技术，该方法采用了剧毒的丙酮氰醇作为反应原料，且丙酮 氰醇不易得，价格偏高，有其局限性。中国专利CN101007772对其进行了一定改进，采用氰 化钠替代丙酮氰醇为反应原料，降低了原料成本，但存在同样缺点是氰化钠也是剧毒的化 工原料，同时反应步骤多，总收率不高。陈新志在中国专利CN1962613中，公开了以正戊酸 为起始原料经酰氯化、溴化、氨化、拆分、重结晶、水解合成L-正缬氨酸的技术，同时在中 国专利CN101007774中公开了相同工艺路线合成D-正缬氨酸的技术，上述两专利避免了 使用剧毒原料，降低了生产成本，但仍然存在反应步骤多，总收率不高等问题。中国专利 CN101508654A公开了一种DL-正缬氨酸的合成方法，以正戊酸为主要起始原料，依次经过 溴代、氨解、离子交换分离回收得到DL-正缬氨酸，再进一步经化学拆分或酶法拆分得到手 性正缬氨酸。该专利提高了合成段的收率，但需要进一步拆分才能得到L-正缬氨酸，反应 步骤多，总收率不高。
[0004] L-亮氨酸是合成新型静脉抗肿瘤药物卡非佐米的关键中间体。L-亮氨酸大部分 通过发酵法提取获得，也可以直接通过化学法合成。国内外相关专利和论文报告，L-亮氨 酸提取方法主要有沉淀法、离子交换法提取、乳状液膜法，其中离子交换法提取分离效果和 效率较高，过程主要包括：离心处理发酵液，加入晶种后进行多次重结晶，然后加入活性炭 脱色，阳离子交换树脂层析后浓缩抽滤粗结晶再加入95%的乙醇重结晶过滤干燥得到成 品。整个过程繁琐复杂，能耗高，收率只有71. 28%，同时对设备的要求严苛，不便于工业化 生产。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中L-亮氨酸的合成方法存在过程繁琐、反应条件苛刻、收率低、分 离提纯困难等一系列缺陷，本发明的目的是在于提供一种基于生物酶为催化剂，以醛类化 合物和甘氨酸原料在温和条件条件下高产率合成高纯度L- α -氨基酸的方法，该方法以水 相为反应体系，环保、廉价，设备要求低、酶可以反复使用，成本低，满足工业化生产。
[0006] 本发明提供了一种高纯L-α-氨基酸的生物合成方法，该方法是在反应液中，醛 类化合物和甘氨酸原料在L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶的催化作用下，于pH 为6. 0?8. 0,温度为20?40°C的条件下进行酶催化反应I，反应产物通过层析分离后，得 到2-酮酸溶液；将所得2-酮酸溶液调节pH到7. 5?8. 5后，加入由亮氨酸脱氢酶与甲酸 脱氢酶或葡萄糖脱氢酶组成的辅酶，在20?40°C温度下进行酶催化反应II，反应产物依 次经过电渗析脱盐、活性炭脱色、浓缩结晶、真空干燥处理，得到L-α -氨基酸晶体；所述的 L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶中L-苏氨酸醛缩酶与L-苏氨酸脱氨酶的总活 力比为3?4:2?3 ;所述的辅酶中亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶的总活力 比为1:1. 5?2. 5 ;
[0007] 所述的醛类化合物具有式1结构：
[0008]
【权利要求】
1. 高纯L-α-氨基酸的生物合成方法，其特征在于，在反应液中，醛类化合物和甘氨酸 原料在L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶的催化作用下，于pH为6.O?8. 0,温度 为20?40°C的条件下进行酶催化反应I，反应产物通过层析分离后，得到2-酮酸溶液；将 所得2-酮酸溶液调节pH到7. 5?8. 5后，加入由亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱 氢酶组成的辅酶，在20?40°C温度下进行酶催化反应II，反应产物依次经过电渗析脱盐、 活性炭脱色、浓缩结晶、真空干燥处理，得到L-α-氨基酸晶体；所述的L-苏氨酸醛缩酶和 L-苏氨酸脱氨酶复合酶中L-苏氨酸醛缩酶与L-苏氨酸脱氨酶的总活力比为3?4:2? 3 ;所述的辅酶中亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶的总活力比为1:1. 5?2. 5 ; 所述的醛类化合物具有式1结构：
所述的2-酮酸具有式2结构 所述的L-α-氨基酸具有式3 其中， R为C1?C4的脂肪烃基。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，R为C1?C4的直链烷烃基或直链取代烷烃 基、烯烃基或取代烯烃基、炔基或取代炔基中一种。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，L-苏氨酸醛缩酶在反应液中的加入量相对 于醛类化合物为30000U/mol?80000U/mol，L-苏氨酸脱氨酶在反应液中的加入量相对于 醛类化合物为20000U/mol?60000U/mol。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，亮氨酸脱氢酶在2-酮酸溶液中的加入量相 对于2-酮酸为10000U/mol?16000U/mol，甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶在2-酮酸溶液中的 加入量相对于2-酮酸为20000U/mol?32000U/mol。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，醛类化合物在反应液中的质量百分比浓度 为2%?10%，醛类化合物与甘氨酸的摩尔比为1:1?1. 05。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，酶催化反应II过程中加入不少于20ppm的 NAD或NADP辅组因子，和质量为2-酮酸溶液的3?7%的甲酸铵或葡萄糖。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，酶催化反应II所得反应产物通过电渗析脱 盐后，维持温度在20?40°C范围内，加入活性炭进行吸附0. 5?I.Oh;其中，活性炭为木质 活性炭，木质活性炭的使用量为2-酮酸溶液体积的3. 0?5. 0%。。
8. 如权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述的电渗析脱盐过程中采用的极水 为电导在5. 0?10.Oms/cm之间的硫酸钠溶液，浓水为去离子水，终止物料电导为8. 0? 10.Oms/cm〇
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶催化反应I以反应液中甘氨酸残留 量低于0. 2wt%为反应终点；酶催化反应II以2-酮酸溶液中2-酮酸残留量低于0. 2wt%为 反应终点。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的层析分离是通过离子交换树脂或吸 附树脂进行分离。
【文档编号】C12P13/04GK104313071SQ201410552914
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】许岗, 曾红宇, 帅得利, 王胜锋 申请人:湖南宝利士生物技术有限公司