一种鱼源无乳链球菌的荧光定量pcr检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，本发明方法步骤包括鱼源无乳链球菌DNA的提取、引物设计、标准质粒模板的制备、荧光定量PCR退火温度的优化、绘制标准曲线、敏感性和特异性检测。本发明可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出水产养殖动物感染无乳链球菌，灵敏度可达8.6细菌基因组拷贝/μL，对鱼类无乳链球菌病的预防有重大意义。
【专利说明】-种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细菌检测【技术领域】，具体涉及一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检 测方法。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)，也称B族链球菌，是兼性的革兰氏阳 性球菌，是一种重要的人、兽及鱼共患病致病菌。鱼源无乳链球菌可引起鱼类败血症和脑膜 炎，具有较高的致病率和致死率。现有的鱼源无乳链球菌的检测方法主要有常规的细菌分 离培养鉴定法、普通PCR检测法、环介导等温扩增技术（LAMP)检测法等。细菌分离培养方 法存在耗时和受样品污染等诸多因素的影响；普通PCR既无法对病原定量，又需要凝胶电 泳，容易对环境造成污染；LAMP法虽然灵敏性高，但不能对病原进行定量；而荧光定量PCR 技术通过在PCR反应体系中加入可嵌入双链DNA的荧光燃料，利用相应软件实时监测整个 PCR进程中的荧光信号积累情况，对未知模板可进行定性和定量分析，该方法可实时检测、 速度快、高通量、定量准确、灵敏度高、特异性好、自动化程度高，在病原微生物检测方面已 得到广泛应用，目前，尚无荧光定量PCR方法用于检测鱼源无乳链球菌的相关报道。近年 来，鱼类无乳链球菌病大面积爆发流行，该病缺乏有效的治疗方法，防止无乳链球菌的传染 和流行是当前采取的主要措施，早期快速检测该病原是减少损失的有效途径，荧光定量PCR 技术应用于水产动物无乳链球菌的检测，对于疾病的预防意义重大。
【发明内容】
[0003] 为解决【背景技术】中的检测临床样品中鱼源无乳链球菌的问题，本发明提供一种鱼 源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，该方法可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出水 产养殖动物感染无乳链球菌，为防止鱼源无乳链球菌的传染和流行提供技术支持。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
[0005] (1)取患病鱼的组织50?lOOmg，称重后，放入组织匀浆器中研磨，加入1000 μ L TE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180 μ L，加入20 μ L浓度为50mg/mL的溶菌酶， 30°C孵育IOmin ;后续的提取步骤按照细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯度细 菌基因组DNA，保存于-20°C备用。
[0006] (2)根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S-23S rRNA基因间区序列，设计一对特 异性引物，序列如下：
[0007] 上游引物151?-8:5'66六六六0^60^1'11^〇61'(：1'-3'；
[0008] 下游引物 ISR-a:5' AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3'。
[0009] (3)使用上述特异性引物扩增出大小为190bp的片段；通过连接、转化将该片段插 入pMD? 18-T载体；最后对pMD? 18-T重组质粒进行鉴定。
[0010] (4)提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用Thermo NanoDrop 2000进行质粒浓 度检测，计算出重组质粒的拷贝数，将质粒进行10倍稀释法稀释成6. 04X IO8?6. 04X IO1 拷贝/ μ L的8个浓度梯度，将其作为标准质粒模板。
[0011] (5)将标准质粒作为模板，构建反应体系，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线 和标准曲线。
[0012] (6)将已经计算出拷贝数的重组质粒进行10倍梯度稀释，选取6. 04Χ IO4? 6. 04X KT1拷贝/ μ L的6个浓度梯度，进行荧光定量PCR检测，以此确定荧光定量PCR所 能检测的最低模板拷贝数，验证本发明方法的灵敏性。
[0013] (7)分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、 蛳鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康 斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增，验证本发明方法的特 异性。
[0014] 其中本发明所述步骤5-7中，所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反应体积 20 μ L，其中 SYBR Green I PCR Master Mix 预混液（2X) 10 μ L、10y M 上、下游引物各 〇. 5 μ L、模板DNA I. 0 μ L、无菌水8. 0 μ L ;反应程序为：预变性94°C，lmin，1个循环；随后 进行40个循环，程序为94°C，30sec，退火60. 4°C，20sec，延伸72°C，20sec，同时设溶解曲线 反应参数为 94,15sec，60°C，30sec，94,15sec。
[0015] 其中本发明中Ct值与质粒拷贝数的对数之间表现出良好的线性关系，相关系数R2 =0· 990,截距为36. 28,斜率为-3. 195,扩增效率E = 106. 0%，从而可以算出拷贝数X与Ct 值之间的线性关系方程式：Ct =-3. 1951ogX+36. 28,而待测样品的Ct值可以从实验结果中 直接读取；把待测样品的Ct值代入方程式就可以算出无乳链球菌ISR的单拷贝数（X)。由 于无乳链球菌的基因组内含有7个拷贝的ISR序列，则样品中的无乳链球菌基因组拷贝数 =X/7。
[0016] 其中在反应结束后进行溶解曲线分析，扩增产物的溶解温度为90. 8-91. 2°C，无非 特异性产物和引物二聚体的峰值出血标准品均一稳定。
[0017] 其中分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆 菌、蛳鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健 康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增。无乳链球菌感染 的罗非鱼DNA模板出现特异性扩增曲线，而其他样品均未出现相应的扩增曲线，同时将扩 增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果与上述一致，表明该方法具有较好的特异性。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1不同退火温度下的扩增结果，图上部分显示不同退火温度所对应Ct值，图下 部分为不同退火温度下产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0019] 图2不同稀释浓度的阳性质粒为模板的荧光定量PCR扩增曲线。从左到右各条 曲线代表 6· 04X 1086· 04X 107、6· 04X 106、6· 04X 105、6· 04X 104、6· 04X 103、6· 04X 102、 6. 04X IO1质粒拷贝数/ μ L扩增曲线。
[0020] 图3荧光定量PCR标准曲线结果，回归方程Ct = -3. 1951ogX+36.28,相关系数R2 =0· 990,扩增效率 E = 106. 0%。
[0021] 图4扩增产物的溶解曲线分析，溶解温度在90. 8-91. 2°C之间。
[0022] 图5荧光定量PCR特异性检测。以不同样品的DNA模板，按照构建的荧光定量PCR 方法进行扩增，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。泳道M，DL2000marker ;泳道1，无乳链 球菌感染的罗非鱼DNA ;泳道2,海豚链球菌DNA ;泳道3,金黄色葡萄球菌DNA ;泳道4,海分 枝杆菌DNA ;泳道5,蛳鱼诺卡氏菌DNA ;泳道6,迟缓爱德华氏菌DNA ;泳道7,哈维弧菌DNA ; 泳道8,美人鱼发光杆菌杀鱼亚种DNA ;泳道9,斑点叉尾鮰DNA ;泳道10,罗非鱼DNA ;泳道 11，人DNA标准品。
[0023] 图6荧光定量PCR方法检测感染无乳链球菌的罗非鱼样品。横坐标代表用于感染 罗非鱼的不同无乳链球菌菌株；纵坐标代表攻毒14天后，罗非鱼脑组织内的无乳链球菌基 因组DNA载量。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0025] 实施例一荧光定量PCR检测无乳链球菌方法的建立
[0026] 1.样品基因组DNA提取
[0027] (1)鱼（包括鱼体内细菌）基因组DNA提取：取鱼的组织50?lOOmg，称重后，放入 组织织匀浆器中研磨，加入1000 μ LTE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180 μ L，加 入20 μ L浓度为50mg/mL的溶菌酶，30°C孵育IOmin ;后续的提取步骤按照OMEGABacterial DNAKit细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯度的鱼（鱼包括体内细菌）基因组 DNA，保存于-20°C备用。其中OMEGA Bacterial DNA Kit试剂盒（OMEGA公司）购于广州飞 扬生物工程有限公司。
[0028] (2)细菌基因组DNA提取：分别培养无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、 海分枝杆菌、蛳鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，按照 OMEGA Bacterial DNA Kit细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，得到高纯度的细菌基因组 DNA，保存于-20°C备用。
[0029] 2.引物设计与合成
[0030] 根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S-23S rRNA基因间区序列（ISR)，通过 Primer Premier 6.0软件设计的，并按照本领域常规方法合成。引物序列如下：
[0031] 上游引物151?-8:5'-66六六六0^60^1'11^〇61'(：1'-3'；
[0032] 下游引物 ISR-a:5' -AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3'。
[0033] 其中ISR-s/a预期片段为190bp。
[0034] 3.标准品模板的制备：
[0035] 以上述提取的无乳链球菌基因组DNA为模板，使用上述设计的特异性引物扩增出 大小为190bp的片段；通过连接、转化将该片段插入pMD? 18-T载体；最后对pMD? 18-T重 组质粒进行鉴定，命名为pMD? 18-T-ISR。
[0036] 阳性质粒（pMD? 18-T-ISR)，交上海生工生物工程公司测序鉴定。用细菌质粒 DNA小提试剂盒提取质粒DNA，用Thermo NanoDrop 2000检测质粒浓度，此质粒溶液即为本 发明的标准品模板。
[0037] 根据阿伏加德罗常数、碱基的平均分子量、重组质粒的长度及浓度计算单位体积 质粒溶液内的拷贝数。其计算公式如下：每μ L质粒溶液的拷贝数=[质粒浓度（g/μ L) X 阿伏伽德罗常数]/[重组质粒分子量Χ660]。
[0038] 经计算得pMD? 18-T-ISR浓度为6. 04X 101°拷贝/ μ L，将质粒稀释成： 6. 04X 108、6. 04X 107、6. 04X 106、6. 04X 105、6. 04X 104、6. 04X 103、6. 04X 102、6. 04X IO1 拷贝/ μ L的浓度，于-20°c保存备用。
[0039] 4.荧光定量PCR反应条件及其优化
[0040] 反应体系（20 μ L)为：SYBR Green I PCR Master Mix 预混液（2 X) 10 μ UlOyM 上、下游引物各0.5 μ L、模板DNA 1.0 μ L、无菌水8.0 μ L。本申请实施例中实际使用SYBR Green I PCR Master Mix预混液（2X) (Τ0Υ0Β0公司）购自广州美津生物技术有限公司； 所使用引物为上述设计的特异性引物。
[0041] 退火条件优化：预变性94°C，lmin，1个循环；随后进行40个循环，程序为94°C， 30sec，退火55. 0?64. 9°C，20sec，延伸72°C，20sec，同时设溶解曲线反应参数为94， 15sec，60 °C，30sec，94,15sec。本申请实施例中实际使用 Eppendorf 公司的 Eppendorf Mastercycler ep realplex型突光定量PCR仪记录结果。
[0042] 最佳退火温度的确定：以实施例1中提取的无乳链球菌DNA为模板，按照上述反 应体系和反应条件，比较不同退火温度下的扩增产物所对应Ct值，结合琼脂糖凝胶电泳结 果，确定荧光定量PCR的最佳退火温度。反应的最佳退火温度为60. 4°C (如附图1)。
[0043] 5.方法学评价
[0044] (1)标准曲线制作·
[0045] 将上述已定量的标准品（重组质粒）以10倍的倍比关系作一系列稀释，以 不同稀释浓度的标准品作为模板，分别取LOyL按照上面的反应体系和反应条件进 行荧光定量PCR，制作标准曲线（如附图2)。荧光定量PCR标准曲线的回归方程Ct =-3. 1951ogX+36.28,相关系数R2 = 0.990,扩增效率E = 106.0%，用阳性质粒所作 的标准曲线的Ct值与初始浓度有较好的线性关系（如附图3)，标准品的溶解温度都在 90. 8-91. 2°C之间（如附图4)。
[0046] (2)灵敏度测试
[0047] 将已定量的标准品进行 10 倍稀释为 6. 04X 104、6. 04X 103、6. 04X 102、6. 04X 101、 6. 04X 10°、6. 04X KT1拷贝/ μ L，用建立的荧光定量PCR方法进行检测，以此确定检测的灵 敏度。结果显示，当重组质粒浓度为60. 4拷贝/ μ L，即8. 6无乳链球菌基因组拷贝/ μ L 时，仍能够获得扩增曲线和特异的溶解曲线。
[0048] (3)特异性验证
[0049] 为了 了解该方法的特异性，选用无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡 萄球菌、海分枝杆菌、蛳鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚 种、健康罗非鱼和健康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩 增。在所检测的样品中，仅无乳链球菌感染的罗非鱼DNA样品结果为阳性，而其他样品的检 测结果均为阴性。同时将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果与上述一致（如附图5)。 表明建立的荧光定量PCR方法不会受这些水产动物病原菌的及宿主的干扰，也不会受操作 过程中人的DNA的干扰。
[0050] (4)荧光定量PCR稳定性和重复性测试
[0051] 在评价荧光定量PCR检测无乳链球菌方法的重现性和稳定性，用阳性样品和阴性 样品，按照上述反应体系和反应条件，反复进行荧光定量PCR检测，每次试验的每个样品做 8个平行反应管，重复6次，结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法具有很好的稳定性和 重复性。
[0052] (5)样品中的无乳链球菌定量
[0053] 待测样品的Ct值可以在荧光定量PCR仪中直接读取，把待测样品的Ct值代入到 标准曲线回归方程式可以算出无乳链球菌ISR的单拷贝数（X)。由于无乳链球菌的基因组 内含有7个拷贝的ISR序列，则最终样品中的无乳链球菌拷贝数=X/7。
[0054] 实施例二用本发明建立的荧光定量PCR方法检测样品
[0055] 选取10株不同毒力的无乳链球菌感染罗非鱼，攻毒后第14天采集样品。
[0056] 1.分离培养法
[0057] 将样品接种于血琼脂平板上，置28°C培养24_48h，观察菌落，如见形成灰白色、表 面光滑、有乳光、圆形、β溶血的菌落，则进行革兰氏染色镜检，发现单个、成双、链状排列、 长短不一，呈紫色的球菌。
[0058] 2.荧光定量PCR法
[0059] (1)样品DNA提取
[0060] 将样品称重后，放入组织织匀浆器中研磨，加入1000 μ LTE缓冲液，制成组织匀浆 液。取组织匀浆液180 μ L，加入20 μ L浓度为50mg/mL的溶菌酶，30°C孵育IOmin ;后续的 提取步骤按照OMEGA Bacterial DNA Kit细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯 度的鱼（鱼包括体内细菌）基因组DNA。
[0061] (2)荧光定量PCR反应
[0062] 将一系列不同稀释浓度的重组质粒标准品和提取的样品DNA作为模板，进行荧光 定量PCR检测，同时设阴性对照。反应体系（20 μ L)为：SYBR Green I PCR Master Mix预 混液（2X) IOyLUO μ M上、下游引物各0.5 μ L、模板DNA 1.0 μ L、无菌水8.0 μ L。放入 Eppendorf Mastercycler ep realplex 型突光定量 PCR 仪。反应条件：预变性 94°C，lmin， 1个循环；随后进行40个循环，程序为94°C，30sec，退火60. 4°C，20sec，延伸72°C，20sec， 同时设溶解曲线反应参数为94,15sec，60°C，30sec，94,15sec。反应结束后利用荧光定量 PCR软件分析。
[0063] (3)结果计算
[0064] 各扩增曲线与阈值线的交叉点对应的横坐标即为Ct值，根据标准曲线上浓度与 Ct值的对应关系，可求出各待测样品中无乳链球菌ISR的单拷贝数（X)，则最终样品中的无 乳链球菌拷贝数=X/7。
[0065] (4)数据分析
[0066] 采样EXCLE软件包，培养法和所建立的荧光定量PCR方法对样品检测结果阳性率 的比较采样X2检验。
[0067] 应用所建立的荧光定量PCR方法和培养法对人工感染无乳链球菌的罗非鱼30个 样品进行检测，经统计分析发现，这两种方法有显著性差异（P < 0. 05)。荧光定量PCR阳性 检出率（100% )明显高于培养法（76. 7% )。此外，荧光定量PCR还可对样品中无乳链球菌 进行定量分析（图5)，判定无乳链球菌在鱼体内的定植情况。
[0068] 综上所述，本发明的有益效果是：基于重组质粒pMD? 18-T-ISR所建立的鱼源无 乳链球菌实时定量PCR检测方法具有检测速度快（2个小时左右）、操作简便、结果可靠等特 点，该方法具有较好的敏感性和特异性，不仅可提高检出率，还能定量出患病鱼的无乳链球 菌的DNA载量，与传统方法相比，明显优于培养法。
【权利要求】
1. 一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于其检测方法的具体步骤 如下： (1) 提取鱼组织内的无乳链球菌DNA，制备检测液。 (2) 引物设计：根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S-23S rRNA基因间区序列，通过 Primer Premier6. O软件设计相应的特异性引物，序列如下： 上游引物 I SR-s : 5，-GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3，； 下游引物 I SR-a : 5 ' -AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3 '。 (3) 标准品模板的制备：使用上述特异性引物扩增出大小为190bp的片段；通过连接、 转化将该片段插入pMD?18-T载体；最后对pMD?18-T重组质粒进行鉴定。提取经过 测序鉴定重组质粒，进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，将质粒进行10倍稀释 法稀释成 6· 04X 108、6· 04X 107、6· 04X 106、6· 04X 105、6· 04X 104、6· 04X 103、6· 04X 102、 6. 04Χ IO1拷贝/ μ L的8个浓度梯度，将其作为标准质粒模板，其中单位体积质粒溶液内 的拷贝数计算公式如下：每μ L质粒溶液的拷贝数=[质粒浓度（g/μ L)X阿伏伽德罗常 数]/[重组质粒分子量Χ660]。 (4) 标准曲线制备：将标准质粒作为模板，构建反应体系，进行荧光定量PCR扩增，获得 扩增曲线和标准曲线。 (5) 将已经计算出拷贝数的重组质粒进行10倍梯度稀释，选取6. 04Χ 104、6. 04Χ 103、 6. 04X 102、6. (MXlO1J. 04Χ10°、6. 04ΧΚΓ1拷贝/ μ L的6个浓度梯度，进行荧光定量PCR 检测，以此确定荧光定量PCR所能检测的最低重组质粒拷贝数，验证本发明方法的敏感性。 (6) 分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、蛳鱼 诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康斑点 叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增，验证本发明方法的特异 性。 (7) 样品中的无乳链球菌定量计算方法：在荧光定量PCR仪中直接读取待测样品的Ct 值，将Ct值代入到标准曲线回归方程式，计算出无乳链球菌ISR的单拷贝数（X)。由于无乳 链球菌的基因组内含有7个拷贝的ISR序列，则最终样品中的无乳链球菌拷贝数=Χ/7。
2. 根据权利要求1所述的一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于 鱼组织内无乳链球菌DNA的提取方法为：取病鱼的组织50?lOOmg，称重后，放入组织织匀 浆器中研磨，加入1000 μ L TE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180 μ L，加入20 μ L 浓度为50mg/mL的溶菌酶，30°C孵育IOmin后续的提取步骤按照常规试剂盒的提取方法进 行，即得到高纯度的含细菌和鱼基因组DNA，保存于-20°C备用。
3. 根据权利要求1所述的一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在 于步骤4-6中所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反应体积20 μ L，其中SYBR Green I PCR Master Mix预混液（2X) 10 μ LUOyM上、下游引物各0.5 μ L、模板DNALO μ L、无菌 水8. 0 μ L ;荧光定量PCR反应程序为：预变性94°C，lmin，1个循环；随后进行40个循环， 程序为94°C，30sec，退火60. 4°C，20sec，延伸72°C，20sec，同时设溶解曲线反应参数为94， 15sec,60°C,30sec,94,15sec〇
【文档编号】C12Q1/06GK104263842SQ201410553158
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月5日 优先权日:2014年10月5日
【发明者】李安兴, 苏友禄 申请人:中山大学