一种产小分子透明质酸的重组枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产小分子透明质酸的重组枯草芽孢杆菌,属于生物工程【技术领域】。本发明采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA整合于枯草芽孢杆菌实现了透明质酸的生产;同时,对HA的合成途径关键基因进行过表达实现HA在枯草芽孢杆菌的高产。在此基础上,引入水蛭来源的透明质酸酶整合至枯草芽孢杆菌基因组上,置于受IPTG诱导控制的启动子Pgrac下分泌表达,通过控制透明质酸酶的分泌表达量和诱导启动时间来制备不同分子量的小分子透明质酸产物,制备的产物分子量范围有差异,对于微生物直接生产特定范围的小分子透明质酸具有重要的指导借鉴意义。本发明为高效制备小分子透明质酸奠定了一定的基础,适合于工业化生产应用。
【专利说明】一种产小分子透明质酸的重组枯草芽孢杆菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产小分子透明质酸的重组枯草芽孢杆菌,尤其是一种构建重组枯 草芽孢杆菌发酵葡萄糖联产透明质酸酶和小分子透明质酸的方法,属于生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 透明质酸(Hyaluronic Acid, HA),是一种高分子粘性多糖,以其独特的分子结构 和理化性质,使其具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性,是目前发现的自然界中保 湿性最好的物质,同时无任何免疫原性和毒性,被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领 域。近年来研究发现,低分子量的HA和透明质酸寡糖(低于IXlO 4)具有独特的生物学 功能。此外,HA寡糖容易被人体吸收而用于人体自身HA等多糖合成的前体,因此,HA寡 糖在食品保健以及医药领域具有重要的应用前景。目前,虽然已有报道采用从头合成的 方法来制备HA寡糖,但由于化学合成存在底物昂贵、步骤繁琐以及合成效率低等多问题, 难以实现HA寡糖制备应用。相比较,酶法催化合成HA寡糖是一种很有潜力的方法,但需 要制备大量的透明质酸酶液和控制反应条件。因此,将微生物发酵生产HA和透明质酸酶 (Hyaluronidase, HAase)相偶联,实现一菌发酵直接生产获取HA寡糖和透明质酸酶两种产 物,具有一定的研究意义和工业化潜力。
[0003] HA广泛地存在于各种动物组织内,如鸡冠、关节滑液、软骨、眼玻璃体等,同时发现 HA也存在于产气杆菌、绿脓杆菌和A、B、C溶血性链球菌等部分细菌中。由于动物提取工艺 复杂、效率低以及存在病毒种间交叉感染和其它风险性的感染,近些年以来,透明质酸的获 取已经普遍由传统的动物组织提法转变为微生物发酵法,而应用最广的是致病性弱的溶血 性链球菌C族菌,如Streptococcus equi和S. zooepidemicus,而且微生物发酵法获得的 HA多为大分子量的HA。随着DNA重组技术、DNA测序技术以及代谢工程的发展,构建重组 工程菌株合成HA也引起了广泛关注。在过去几年里,虽然微生物发酵合成HA已经获得普 遍的应用,然而微生物发酵法获得的HA的分子量多为大分子量的HA和中分子量的HA,而直 接发酵合成小分子HA尚无报道。如何构建微生物重组菌株合成不同分子量HA、尤其是小分 子量HA已经成为迫切需要解决的问题。
[0004] 随着小分子HA和HA寡糖的研究与应用迅速兴起,近些年以来,国内外开始重视 HA的降解及其降解产物的制备研究。目前,HA降解的方法主要有物理降解、化学降解、生 物降解3大类。物理降解方法主要有加热、机械剪切力、紫外线、超声波、 6tlCo照射、Y-射 线辐射等因素均可使HA发生降解。但是,物理法制备的HA分子量普遍高于1万以上,产生 的分子量范围分布较大,产品稳定性较差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法,水 解法分酸水解(HCl)和碱水解(NaOH),氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠(NaClO)和过氧 化氢(H 2O2)15尽管使用化学降解方法降解产物的相对分子质量可以通过改变酸碱或氧化剂 的加入量和反应时间来控制,降解成本较低,易于大规模生产,但化学降解法引入了化学试 齐U,反应条件复杂,易给HA性质产生影响和产品的纯化带来困难,且产生大量的工业废水。 生物酶法降解是HA在透明质酸酶(HAase)的作用下,糖链上的糖苷键断裂发生降解。酶解 法是温和的降解方法,不但可以制备小分子HA,而且利用此方法可制得链长为4?22的寡 糖,而且经过凝胶色谱分离后可以制得单一 HA寡糖。但是,目前商品化的透明质酸酶价格 昂贵,不适合应用于工业化制备小分子HA。
[0005] 透明质酸酶(Hyaluronidase, HAase),是广泛分布于自然界中的一类可降解 透明质酸的酶的总称。根据HAase的来源、结构和作用机制,HAase可以分为三类:内 切-P-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1.35,主要存在于哺乳动物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等 毒液)、内切-¢-葡萄糖醛酸苷酶(EC 3.2. 1.36,主要存在于水蛭)以及透明质酸裂解酶 (EC 4.2.2. 1,主要存在于细菌、噬菌体以及真菌)。透明质酸酶作为"扩散因子"在临床上 被广泛应用于药物扩散助剂,而目前商品化的透明质酸酶主要以牛睾丸组织提取制备,产 品质量差,价格昂贵和具有动物疫源感染风险。
[0006] 本发明在食品级微生物Bacillus subtilis中构建HA的合成途径,通过对合成HA 的途径中的关键基因进行调控表达(M)P-GlcNAc和UDP-GlcA两个前体物的合成途径关键 基因),实现HA在食品级微生物Bacillus subtilis中的高产。同时,在构建的合成HA工 程菌中进行分泌表达水蛭HAase,实现一菌同步发酵生产HA和HAase,在发酵液中直接制备 生产HA寡糖产物。这一偶联模式不仅解决了当前微生物生产HA过程中由于粘度过高导致 发酵停滞,产量难以获得大幅度突破的瓶颈问题,尤其是本项目首次实现微生物高效合成 HA寡糖,这具有巨大的应用价值和经济效益。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种产小分子透明质酸的重组枯草芽孢杆菌,是在枯草芽孢杆菌内 构建了合成透明质酸的途径并偶联分泌表达透明质酸酶。为构建产透明质酸的途径,在 枯草芽孢杆菌中表达了编码透明质酸合酶的基因hasA、UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD、 UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU和氨基转移酶的基因glmS。
[0008] 在本发明的一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌宿主为Bacillus subtilis 168。
[0009] 在本发明的一种实施方式中,所述透明质酸合酶编码基因hasA可以来源于兽疫 链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌(Streptococcus equi)或类马链球菌 (Streptococcus equissp)。在本发明的一种实施方式中,编码所述透明质酸合酶的基因 hasA来源于兽疫链球菌,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 在本发明的一种实施方式中,tuaD、glmU和glmS可选择链球菌属(Streptococcus species)、大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌(Bacillus)来源。在本发明的一种实 施方式中,编码所述的途径关键基因来源于枯草芽孢杆菌=UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示,编码所述UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示,编码所述氨基转移酶的基因glmS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4 所示。
[0011] 表达HA合成途径的基因的载体为选择游离型载体pP43NMK。
[0012] 表达HA合成途径的基因的启动子为诱导型启动子如Pgrac、Pxyl等。本领域人员 也可以尝试枯草芽孢杆菌组成型启动子如Pveg、PtufA或者P43等。本发明游离型质粒上 选择组成型启动子P43,基因组上选择木糖诱导型启动子Pxyl。
[0013] 在本发明的一种实施方式中,所述hasA整合于于枯草芽孢杆菌基因组上,以木糖 启动子Pxyl启动表达。
[0014] 在本发明的一种实施方式中,所述tuaD、glmU和glmS分别融合P43 RBS序列后, 串联连接到表达载体PP43NMK,转化整合表达hasA的枯草芽孢杆菌。
[0015] 在本发明的一种实施方式中,编码所述透明质酸酶的基因来源于水蛭(SEQ ID NO. 5),进一步融合编码6个组氨酸的序列使得编码的透明质酸酶的N端带有6个组氨酸, 融合编码yweA信号肽和Pgrac启动子的序列后整合到含透明质酸合成途径的枯草芽孢杆 菌基因组上进行表达。编码所述透明质酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。启动透 明质酸酶表达的启动子可以为芽孢杆菌来源的诱导型启动子,本发明的一种实施方式采用 IPTG诱导型启动子Pgrac。引导透明质酸酶分泌的信号肽为amyX、Bpr、Csn、nprE、oppA、 yweA等,本发明的一种实施方式采用yweA信号肽。
[0016] 本发明还提供一种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法,主要包括以下步骤:
[0017] (1)构建透明质酸的合成途径:将编码透明质酸合酶的基因hasA与pAXOl质粒 (自身带有木糖启动子Pxyl)重组,置于木糖诱导型启动子Pxyl控制下,整合于枯草芽孢 杆菌基因组0 -半乳糖苷酶(IacA)位点上表达,将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD与 P43 RBS序列融合,UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU与P43 RBS序列融合,编 码所述氨基转移酶的基因glmS与P43 RBS序列融合,再将三个融合片段串联重组至表达载 体PP43NMK,转化枯草芽孢杆菌得到含透明质酸合成途径的重组菌株;
[0018] ⑵偶联表达透明质酸酶:将透明质酸酶基因融合编码6各组氨酸的序列、启动子 Pgrac和YweA信号肽(SEQ ID NO. 9)后整合到步骤(1)所得重组枯草芽孢杆菌的基因组 中,获得偶联表达透明质酸酶的重组枯草芽孢杆菌。
[0019] 在本发明的一种实施方式中,步骤(2)选定枯草芽孢杆菌基因组上乳酸脱氢酶基 因作为透明质酸酶整合位点。
[0020] 所述步骤(2)中的透明质酸酶的表达量可采用对启动子的诱导强度和诱导时间 进行调整。透明质酸酶的表达量越大,重组枯草芽孢杆菌产的HA的分子量就越小。
[0021] 本发明还提供一种应用所述重组枯草芽孢杆菌产低分子量HA(104Da〈Mr〈10 5Da) 或透明质酸寡糖(MKlO4Da)的方法,发酵培养基为以蔗糖或葡萄糖作为碳源的无机盐培 养基 :2-5%酵母粉,2-7(%葡萄糖,磷酸二氢钠15.68/1,;硫酸钾3.9 8/1,硫酸镁0.5-28/ L。在37°C下,发酵培养到第2h左右时,添加0. 5-10g/L的木糖,诱导HA的合成,发酵培养 的第0-24h时,添加0. 1-500 ii M的IPTG诱导透明质酸酶基因表达,控制发酵培养时间为 48_96h,获得分子量IO5Da以下的小分子透明质酸。
[0022] 发酵结束后继续静置一段时间,还可获得主要产物为低分子量或者HA-4、HA_6、 HA-8、HA-10等透明质酸寡糖。
[0023] 在本发明的一种实施方式中,采用低浓度0. IuM IPTG诱导,所得重组菌株发酵生 产的HA平均分子量为I X IO5道尔顿。
[0024] 在本发明的另一种实施方式中,采用较低浓度Iy M IPTG诱导,所得重组枯草芽孢 杆菌发酵生产的HA平均分子量为67500道尔顿。
[0025] 在本发明的另一种实施方式中,采用高浓度100 PM IPTG诱导,所得重组枯草芽孢 杆菌发酵生产的HA平均分子量低于I X IO4道尔顿。
[0026] 在本发明的一种实施方式中,发酵温度控制为37°C,发酵时间控制为48h。
[0027] 所得发酵液中的透明质酸酶分离纯化后可用于食品、医药或临床等用途。
[0028] 本发明利用枯草芽孢杆菌产透明质酸,与其他工程菌相比,该发明具有非常大的 应用优势。首先,本发明过程中使用的宿主为食品级,完全满足医疗卫生和食品安全的要 求,无内毒素和病原感染的风险,不会对产物的医用食品安全带来隐患;其次,在产高分子 HA的过程中,HA被同时分泌至胞外的透明质酸酶降解为小分子透明质酸,具有直接的目的 性。本发明偶联表达透明质酸酶,降低了发酵液粘稠度,增加了溶氧和提高了 HA的产量;其 次,发酵液中酶水解制备的小分子寡聚透明质酸的转化产率高达95%以上,产物的分子量 小余IO 5道尔顿,且主要产物为低分子量寡聚糖,易于纯化回收。基于应用分析,本发明方 法在工业上用于制备特定小分子的透明质酸具有潜在而非常广泛的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1所示为水蛭透明质酸酶整合片段的构建示意图。
[0030] 图2所示为第8h采用不浓度的IPTG诱导水蛭透明质酸酶的表达对HA产量的影 响:〇,未添加诱导剂;1,IPTG诱导浓度为0. IiiM ;2, IPTG诱导浓度为IiiM ;3, IPTG诱导浓 度为100 U M。
[0031] 图3所示为采用I i! M的IPTG在不同时间诱导水蛭透明质酸酶的表达对HA产量 的影响:〇,未添加诱导剂;1,第Oh诱导;2,第4h诱导;3,第8h诱导;4,第24h诱导。
【具体实施方式】
[0032] 序列表中为相关核苷酸序列信息:SEQ ID NO. 1为兽疫链球菌来源的透明质酸合 酶hasA基因编码序列;SEQ ID NO. 2为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD基因 编码序列;SEQ ID NO. 3为枯草芽孢杆菌来源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶glmU基 因编码序列;SEQ ID NO. 4为枯草芽孢杆菌来源的氨基转移酶glmS基因编码序列;SEQ ID NO. 5序列信息为水蛭来源的透明质酸酶LHyal基因序列;SEQ ID NO. 6序列信息为人工构 建片段XMZ序列;SEQ ID NO. 7序列信息为Lacl+Pgrac片段序列;SEQ ID NO. 8序列信息为 xylR+Pxyl (木糖阻遏蛋白和启动子)片段序列;SEQ ID NO. 9序列信息为枯草芽孢杆菌来 源的yweA信号肽核苷酸序列信息。
[0033] 发酵产物HA分子量检测分析方法:使用安捷伦公司的高效液相色谱仪1260进行 分析,选择示差检测器RID,使用凝胶色谱柱Ultrahydrogel Linear进行分析。流动相选择 0. IM硝酸钠进行洗脱,柱子温度设定为40摄氏度,进样量40 y L,每个样品洗脱时间25min, 使用中国食品药品检定研究院出产的右旋糖酐作为标准品,利用GPC软件进行平均分子质 量的计算。
[0034] 实施例1整合重组质粒pAXOl-hasA的构建
[0035] 本发明所用的透明质酸合酶hasA基因来源于为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246,Streptococcus zooepidemicus 菌株接种于 5ml M17 液体培 养基,在37°C 200rpm培养16h。收集菌体,采用细菌基因组提取试剂盒提取兽疫链球菌株 的基因组DNA。
[0036] 根据已公布的基因组信息序列,分别设计引物hasA-F/hasA-R,以提取的基因组 DNA为模板,采用标准的PCR扩增体系和程序,扩增获取hasA基因。
[0037] 引物序列信息:5' -3'方向
[0038] hasA-F :CGCGGATCCATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0039] hasA-R : TGCATGCATTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC
[0040] 在上下游引物两端分别引入BamHI和SacII限制性酶切位点。PCR扩增获取的 hasA片段和质粒pAXOl分别采用BamHI和SacII进行双酶切,采用琼脂糖凝胶核酸电泳进 行切胶回收,回收产物进行连接,体系10 :1 双切的载体,4 ill双切的目的片段,5 ill Solution连接酶,16°C连接过夜,转化JM109感受态细胞,挑取单菌落PCR验证,阳性重组子 进行测序,比对正确,重组质粒pAXOl-hasA构建成功。重组质粒转化Bacillus subtilis 168,以20 y g/ml的红霉素平板进行筛选整合重组子,并对重组菌株进行PCR验证和测序验 证,对成功整合Pxyl-hasA的枯草芽孢杆菌菌株命名为ZHA168。
[0041] 实施例2重组质粒pP43NMK/tuaD-glmU-glmS的构建
[0042] Bacillus subtilis 168 菌株接种于 5mlLB 培养基,37°C,200rpm 培养 16h。收 集菌体,采用细菌基因组提取试剂盒提取兽疫链球菌株的基因组DNA。根据已公布的 Bacillus subtilis 168 基因组信息序列,分别设计引物 tuaD-F/tuaD-R、glmU-F/glmU-R 和glmS-F/glmS-R。在上游引物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位点和P43 RBS序列 (AAGAGAGGAATGTACAC),在下游引物tuaD-R的5端引入XhoI和SacI限制性酶切位点;在 上游引物glmU-F的5端引入SacI限制性酶切位点和P43 RBS序列,在下游引物glmU-R的 5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点;在上游引物glmS-F的5端引入SpeI (XbaI的同尾 酶)限制性酶切位点和P43 RBS序列,在下游引物glmS-R的5端引入XhoI和XbaI限制性 酶切位点。引物信息如下:
[0043] tuaD-F :CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG
[0044] tuaD-R : CCGCTCGAGCGGTACATTCGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG
[0045] glmU-F:CGGGGTACCGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG
[0046] glmU-R :CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC
[0047] glmS-F :CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGTGTGGAATCGTAGGTTATATCGG
[0048] glmS-R :CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCCACAGTAACACTCTTCGC
[0049] 以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,采用标准的PCR扩增体系和程序,分别 扩增获取tuaD、glmU和glmS基因。
[0050] 质粒pP43NMK采用KpnI和XhoI双酶切,同时PCR扩增获得的tuaD基因产物也 采用KpnI和XhoI双酶切,经1 %的琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收目标条带,回收产物进行 连接,体系IOu I :1 Ul双切的载体,4 双切的目的片段,5 ill Solution连接酶,16°C 连接过夜,转化JM109感受态细胞,挑取单菌落PCR验证,阳性重组子进行测序,比对正确, pP43NMK/tuaD质粒构建成功。
[0051] 同理,按上述操作将重组质粒pP43NMK/tuaD进行SacI和XhoI双酶切,glmU片段 PCR产物也进行SacI和XhoI双酶切。回收的两个片段进行连接,体系10 ill :1 ill双切的 载体,4 ill双切的目的片段,5 ill Solution连接酶,16°C连接过夜,转化JM109感受态细 胞,挑取单菌落PCR验证,阳性重组子进行测序,结果比对正确,pP43NMK/tuaD-glmU质粒构 建成功。
[0052] 在pP43NMK/tuaD-glmU质粒基础上,按上述操作进行glmS基因的组装:pP43NMK/ tuaD-glmU质粒采用XbaI和XhoI进行双酶切,而glmS片段的PCR产物采用SpeI和XhoI 双酶切,此步采用一对同尾酶进行连接,体系IOul :lul双切的载体,4iU双切的目的片 段,5 ill Solution连接酶,16°C连接过夜,转化JM109感受态细胞,挑取单菌落PCR验证,阳 性重组子进行测序,结果比对正确,pP43NMK/tuaD-glmU-glmS质粒构建成功。
[0053] 上述构建的重组质粒分别转化ZHA168宿主,获得高产HA的重组枯草芽孢杆菌菌 株:ZHA168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS。
[0054] 实施例3水蛭透明质酸酶LHyal基因整合片段的构建
[0055] 以大肠杆菌来源的毒素基因mazF和博来霉素抗性基因Zeocin作为双筛选标记, 构建枯草芽孢杆菌基因组无痕改造片段XMZ (SEQ ID NO. 6)。将mazF基因置于木糖诱导 的启动子Pxyl控制下,具体操作如下:设计引物对Pxyl-F/R、mazF-F/R和Zeo-F/R,分别 扩增xylR+Pxyl (木糖阻遏蛋白和启动子)片段、mazF和Zeocin片段,具体操作程序如 下:xylR+Pxyl和mazF片段各取2 ill混合于PCR管内,加入无菌水21 ill和25 ill 2 X super pfu Master Mix (杭州宝赛生物科技有限公司),混勻后置于PCR仪,按如下程序运 行:94°C 3min,[94°C 30s,50°C 30s,72°C lmin] X10, 72°C 5min。无引物自融合 PCR 结束后, 立即加入引物Pxyl-F和mazF-R各liil,混匀后按如下程序运行:94°C 3min,[94°C 30s, 55°C 30s,72°C lmin] X32, 72°C 5min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收目标 条带,获得Pxyl-mazF片段。
[0056] 同理,按上述融合PCR操作,将Pxyl-mazF片段与zeocin片段进行融合,获得目标 片段 XMZ :Pxyl-mazF_zeocin
[0057] 引物对信息如下:
[0058] Pxyl-F : CTAACTTATAGGGGTAACACTT
[0059] Pxyl-R: GTATCGGCTTACCATTGTACATTTCCCCCTTTGATTTTTAG
[0060] mazF-F :AAAGGGGGAAATGTACAATGGTAAGCCGATACGTACC
[0061] mazF-R : TAAAAAGCCATATCAAGCTACCCAATCAGTACGTTAATT
[0062] Zeo-F :ACGTACTGATTGGGTAGCTTGATATGGCTTTTTATATGTG
[0063] Zeo-R : TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG
[0064] 选定枯草芽孢杆菌基因组上乳酸脱氢酶Idh基因位点作为透明质酸酶整合位点。 采用XMZ无痕操作技术,构建整合片段(见附图1)。先采用融合PCR技术,将来源于质粒 pHTOl的Lacl+Pgrac片段与yweA_sp_H6LHyal基因(在LHyal序列前段已融合yweA信号 肽序列和6个组氨酸序列CACCACCACCACCACCAC)进行融合;在Idh基因两端各取500bp左 右的DNA片段作为同源重组的同源臂Arm-F和Arm-R,同时取Arm-R下游约33bp的序列作 为二次交换序列(DR),融合于XMZ片段前端。最后,采取多次重叠PCR技术,按实施例3融 合片段操作过程和附图2所示顺序,构建完整的基因整合片段。此实施例引物信息序列如 下:
[0065] Arm-F-F :GAAGTGTTGCACAATATAAATGTG
[0066] Arm-R :GGAAAGCGGGCAGTGAATGTTGCGTAAGTCAGGATATCAACCG
[0067] Arm-R-F :CGAGGAGCAGGACTGACGGCCTGCCAAAAGAGCGGGTGAT
[0068] Arm-R-R :TTAGTTGACTTTTTGTTCTGC
[0069] LacI/Pgrac-F :TCCTGACTTACGCAACATTCACTGCCCGCTTTCCAGTCG
[0070] Lacl/Pgrac-R :AATGAAGTTCTTTTTAGCATATCCTTCCTCCTTTAATTGG
[0071] H6LHyal-F :TAAAGGAGGAAGGATATGCTAAAAAGAACTTCATTCGTATC
[0072] H6LHyal-R :
[0073] AGCTCAGTGATACCTGCGATCCCTCCGCGATTATTTTTTGCAGGCTTCAACG
[0074] XMZ-F:AGGGATCGCAGGTATCACTGAGCTGAACTAACTTATAGGGGTAACACTT
[0075] XMZ-R:GCTCTTTTGGCAGGCCGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG
[0076] 重组片段制备浓度为500ng/ iil,电转产HA的重组宿主ZHA168/pP43NMK/ tuaD-glmU-glmS,涂布含有25 ii g/mlZeocin的LB平板,置于37°C培养12h,发生同源重组 的菌落携带XMZ片段,可以在此平板上生长。对长出的单菌落转移至含有2 %木糖为的LB 平板上,置于37°C培养12h。在此过程中,以DR序列发生第二次交换,使得XMZ片段丢失, 实现H6LHyal的无痕整合。若未发生二次交换,XMZ未丢失,木糖启动子在诱导下表达毒性 蛋白mazF,使得宿主死亡。因此,在含木糖的LB平板上能生长的菌为成功重组H6LHyal的 宿主,通过提取基因组进行PCR验证和测序,该宿主改造成功,含有水蛭透明质酸酶的重组 菌株命名为 LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS。
[0077] 实施例4重组LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS菌株的摇瓶发酵
[0078] 挑取 LH168/pP43NMK/tuaD-glmU-glmS 重组菌单克隆接种于 5ml 含有 50 ii g/ml Kan的LB培养基,置于200rpm37°C过夜培养。发酵过程操作:16h后接种于250ml三角摇瓶 (装液量25ml)中,发酵培养基为无机盐培养基:2 %酵母粉,7 %葡萄糖,磷酸二氢钠15. 6g/ L,硫酸钾3. 9g/L。按10%的接种量转接于摇瓶(此起点设为第Oh),置于200rpm37°C培 养,在接种后第2h添加2g/L的木糖进行诱导hasA基因表达,继续发酵培养46h。发酵过程 中第8h分别进行不同浓度的IPTG诱导,控制H6LHyal的分泌表达量,以达到不同分子量的 HA,IPTG诱导浓度分为三个梯度:0.1 iiM、Iii MUOOii M。同时,采用Iii M的诱导浓度在不 同的时间点开始诱导:发酵第〇h、4h、8h和24h。
[0079] 收集发酵液,IOOOOrpm下室温离心lOmin。发酵液上清转移置另一离心管中,加入 2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。室温下静置lh,再IOOOOrpm下室 温离心20min,去除干净液体,白色沉淀加入发酵液等体积的IM NaCl溶液充分溶解,适当 稀释后,采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测HA酸含量。从附图2看出,在第8h采用不同的 IPTG诱导浓度诱导H6LHyal的表达,对HA产量的影响幅度在30%左右,100 ii M浓度的IPTG 诱导HA产量比0. I y M的诱导高出45%,说明透明质酸酶的表达量大有助于降解HA,并对 HA的合成有促进作用。同时根据附图3所示不同的诱导时间看出,透明质酸酶的诱导表达 时间在菌体生长的对数后期,对HA的产量较其它诱导时间高一点,但差别不是很大。
[0080] 根据HA产物的分子量测定,不同的IPTG诱导控制透明质酸酶的表达量,所得重组 菌株发酵生产的小分子HA的平均分子量之间有区别。在低浓度0. I y M的诱导剂控制下, 发酵重组菌株获得的平均分子量为I X IO5道尔顿。而在I ii M的诱导浓度下表达透明质酸 酶,发酵重组菌株获得的平均分子量为67500道尔顿。进一步提高IPTG的诱导浓度,加大 透明质酸酶的分泌表达,所得重组枯草芽孢杆菌发酵生产的HA平均分子量低于I X IO4道 尔顿,并且,在发酵结束后,离心收集发酵液上清,继续放置l_3h,继续水解可以获得HA10、 HA8、HA6和HA4等寡糖产物。
[0081] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技 术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种产小分子透明质酸的重组枯草芽孢杆菌,是在枯草芽孢杆菌内构建合成透明质 酸的途径并偶联诱导分泌表达透明质酸酶;所述构建合成透明质酸的途径,是在枯草芽孢 杆菌中表达了编码透明质酸合酶的基因 haSA、UDP-葡萄糖脱氢酶的基因 tuaD、UDP-N-乙酰 氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU和氨基转移酶的基因 glmS。
2. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述透明质酸合酶编码基 因 hasA 来源于兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌(Streptococcus equi)或类马链球菌(Streptococcus equissp) ;tuaD、glmU和glmS来源于链球菌属 (Streptococcus species)、大肠杆菌(Escherichia coli)或芽抱杆菌(Bacillus) 〇
3. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述hasA整合于枯草芽 孢杆菌基因组上,以木糖诱导型启动子Pxyl启动表达;所述tuaD、glmU和glmS分别融合 P43RBS序列后,以表达载体pP43NMK串联表达。
4. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,编码所述透明质酸酶的基 因来源于水蛭,进一步融合编码6个组氨酸的序列使得编码的透明质酸酶的N端带有6个 组氨酸,融合yweA信号肽和Pgrac启动子后整合到含透明质酸合成途径的枯草芽孢杆菌基 因组上进行表达。
5. -种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法,主要包括以下步骤: (1) 构建透明质酸的合成途径:将编码透明质酸合酶的基因 hasA置于木糖诱导型启动 子Pxyl控制下,整合于枯草芽孢杆菌基因组lacA位点上表达,将编码UDP-葡萄糖脱氢酶 的基因 tuaD与P43RBS序列融合,UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU与P43RBS 序列融合,编码所述氨基转移酶的基因 glmS与P43RBS序列融合,再将三个融合片段串联重 组至表达载体PP43NMK,转化枯草芽孢杆菌得到含透明质酸合成途径的重组菌株; (2) 偶联表达透明质酸酶:将透明质酸酶基因融合编码6个组氨酸的序列、YweA信号肽 和启动子Pgrac后整合到步骤(1)所得重组枯草芽孢杆菌的基因组中,获得偶联表达透明 质酸酶的重组枯草芽孢杆菌。
6. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(2)选定枯草芽孢杆菌基因组上乳酸 脱氢酶基因作为透明质酸酶整合位点。
7. -种应用权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌产透明质酸的方法,通过控制诱导剂的 浓度、诱导时间或者信号肽的分泌强度来控制透明质酸酶酶量,以获得不同分子量的小分 子透明质酸产物。
8. -种应用权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌产小分子透明质酸或透明质酸寡 糖的方法,所述小分子透明质酸的分子量为l〇 4Da〈Mr〈105Da,透明质酸寡糖的分子量为 Mr〈104Da,发酵培养基:酵母粉20-50g/L,葡萄糖或蔗糖20-70g/L,磷酸二氢钠15. 6g/L,硫 酸钾3. 9g/L,硫酸镁0. 5-2g/L,在37°C下,发酵培养第2h时,添加0. 5-10g/L的木糖,诱导 HA的合成,发酵培养的第0-24h时,添加0. 1-500 μ Μ的IPTG诱导透明质酸酶基因表达,控 制发酵培养时间为48-96h,获得小分子透明质酸或透明质酸寡糖。
9. 根据权利要求8所述的方法,其特征在于,在发酵培养第2h时,添加2%的木糖诱导 培养,发酵培养至第8h时,添加1 μ MIPTG诱导,IPTG诱导培养40h,得到HA平均分子量为 67500道尔顿。
10. 根据权利要求8所述的方法,其特征在于,在发酵培养第2h时,添加2%的木糖诱 导培养,发酵培养至第8h时,添加100 μ MIPTG诱导,IPTG诱导培养40h,得到HA平均分子 量低于IX 1〇4道尔顿。
【文档编号】C12N1/21GK104293726SQ201410555019
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】康振, 陈坚, 堵国成, 金鹏 申请人:江南大学