一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法
【专利摘要】本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，属于食品生物工程【技术领域】。本发明的方法是对产纤维二糖差向异构酶的全细胞进行预处理后，通过絮凝包埋、交联的方法制备固定化细胞。本发明方法制备得到的酶的酶活和酶活回收率以及pH稳定性都提高了，降低了生产成本，此外该方法操作过程简单，能耗小，为促进洁净、高效、环保的酶法生产乳果糖的工业化生产提供有益的借鉴。
【专利说明】一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，属于食品生物工程技 术领域。
【背景技术】
[0002] 乳果糖（4-0- β -D-吡喃半乳糖基-D-果糖）为乳糖异构物，是一种人工合成的二 糖，又叫乳酮糖或异构化乳糖，是一种双歧杆菌促进因子。目前在世界范围内，乳果糖被广 泛应用于医药、保健、食品添加剂以及动物饲料等行业。在临床医药行业，乳果糖主要用于 治疗肝性脑病、便秘、内毒素以及降血糖、降胆固醇等，在食品行业中被广泛添加到婴幼儿 奶粉、软饮料以及保健品中，主要是发挥其双歧杆菌增殖因子的作用。
[0003]目前，商业化的乳果糖一般由化学法提供。化学法生产乳果糖具有转化率高、可实 现大规模生产等优点，但是化学异构法的缺点也很突出，如反应副产物多、脱盐操作复杂、 高能耗等。为了克服化学异构法存在的各种弊端，酶法生产乳果糖以其反应条件温和、副产 物少、操作简单、安全性高等优点使得生物酶法转化乳糖制备乳果糖的研究成为目前的研 究热点。
[0004] 传统的酶法生产乳果糖采用β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶，存在转化率低、乳果糖 浓度不高等问题。已有研究发现来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维 二糖差向异构酶能够高效催化单一底物乳糖生产乳果糖。因此利用Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶进行乳果糖酶法生产必将成为新的研究热点。
[0005] 但是在大规模的工业化生产中，游离酶无法回收重复使用，不仅会增加生产成本， 而且引入了外源蛋白，给后续的分离纯化造成困难，同时游离酶一般热稳定性、PH稳定性较 差，不适合工业化连续化生产。而酶经过固定化处理后，固定化酶的热稳定性和pH稳定性 都会得到增强，同时固定化酶可以反复回收利用，在实现连续化生产的同时还能简化下游 分离纯化操作步骤，固定化酶应用于工业化生产有着其天然的优越性。
[0006] 如何简单且高效地实现纤维二糖差向异构酶的固定化并应用于乳果糖的连续化 酶法生产必将成为食品行业从业者面临的新任务。
【发明内容】
[0007] 本发明提供的纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，是将产纤维二糖差向异 构酶的全细胞经透化处理后，以壳聚糖和三聚磷酸钠（TPP)作为载体，加入交联剂，采用先 絮凝包埋然后交联的方法，得到固定化的产纤维二糖差向异构酶细胞。
[0008] 本发明提供一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，是将产纤维二糖差向 异构酶的全细胞经透化处理后，加入助滤剂、壳聚糖和三聚磷酸钠（TPP)，待菌体絮凝后，弃 去上清液，即得固定化细胞。
[0009] 所述固定化方法具体是在经透化处理的菌体细胞干重为0. 01_5g每IOOmL的细 胞菌悬液中加入助滤剂混合均匀后，再加入壳聚糖溶液使每IOOmL溶液中含有壳聚糖为 0. 01-lg，再加入TPP溶液使每IOOmL溶液中含有TPP为0. ο?-lg，待菌体絮凝后，弃去上清 液，即得到固定化细胞。
[0010] 所述固定化方法的具体步骤为：
[0011] (1)调节经透化处理过的菌体细胞浓度至每IOOmL溶液中含有干重为0. 1-5. Og的 细胞，调节pH至3. 0-8. 0,形成菌悬液；
[0012] (2)向步骤⑴的菌悬液中每IOOmL加入0. 1-1. Og的助滤剂，混合均勻，形成混合 溶液；
[0013] (3)将壳聚糖溶液加入到步骤⑵所得的混合溶液中，使得到的体系中每IOOmL溶 液中含有壳聚糖的质量为〇. Ol-Ig ;
[0014] (4)缓慢加入TPP溶液到步骤3得到的溶液中，使最终体系中每IOOmL溶液中含有 TPP质量为0. oi-lg，混合均匀，待菌体絮凝后，弃去上清液，即得到固定化细胞。
[0015] 所述透化处理可以被热处理代替，热处理条件是50-80°C下热处理5-120min。
[0016] 所述透化处理，是指将产纤维二糖差向异构酶的细胞悬浮于透化试剂溶液中， 4-30°C下混匀5-120min处理，即得到透化细胞。
[0017] 所述透化处理中，细胞悬浮于透化试剂溶液后的终浓度为每IOOmL溶液中含有干 重为0. 01-5g的细胞。
[0018] 所述透化试剂溶液是以下任意一种或者多种的混合：1-90% (v/v)的乙醇、 0.1-5%卜八）的甲苯、0.01-5%(￥八）的十六烷基三甲基溴化铵（0^)、0.1-5%卜八）异 戊醇。
[0019] 所述透化处理或热处理的细胞可以经真空冷冻干燥或者在20_50°C条件下烘干后 制成菌粉再进行后续处理。
[0020] 所述菌粉制备菌体细胞的菌悬液时，是用缓冲液溶解菌粉并调节缓冲液pH至 3· 0_8· 0〇
[0021] 所述溶解菌粉的缓冲液只要是能调节pH至3-8的都可以，例如以下任意一种： Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲 液、Britton-Robinson 缓冲液、水。
[0022] 所述菌体细胞的制备方法：以一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌作 为生产菌株，经活化、扩大培养至对数期OD 6tltl = 0. 2-2. 0时加入乳糖至终浓度为0. 5-50g/ L，15-45°C，150-250r/min摇床培养8-24h，即获得表达纤维二塘差向异构酶的重组大肠杆 菌。所述基因工程菌是以E. coliBL21(DE3)为宿主、以pET-28a(+)为表达载体，目的基因 来源于 Caldicellulosiruptor saccharolyticus，目标基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0023] 所述助滤剂可以是以下任意一种：硅藻土、珍珠岩、纤维素、石棉、氧化镁、石膏、酸 性白土等。
[0024] 所述助滤剂在本发明的一种实施方式中是硅藻土。
[0025] 所述助滤剂的添加量为每IOOmL菌悬液中加入0. 1-1. 0g。
[0026] 所述壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解在酸性溶液中形成的溶液。
[0027] 所述壳聚糖溶液在本发明的一种实施方式中是将壳聚糖溶解在0. 1-5% (v/v)醋 酸溶液中形成的溶液。
[0028] 所述壳聚糖在本发明的一种实施方式中是脱乙酰度大于95%的壳聚糖。
[0029] 所述步骤4中加入TPP溶液的体积与步骤3得到的溶液的体积比为1:5-5:1。
[0030] 所述固定化方法中的菌体絮凝后，可以向每IOOmL弃去上清的菌体絮凝物中加入 I-IOOmL交联剂体积分数为0-0. 25%的交联剂溶液，交联。所述加入交联剂的交联反应条 件是4-30°C下交联0_5h。加入交联剂处理后得到的固定化细胞酶活更高，酶活稳定性增 强。
[0031] 所述交联剂可以是任何能起到交联作用的试剂，例如：1，5-二氟-2, 4-二硝基苯 或者二甲基己二酰胺等双官能团或者多官能团试剂。
[0032] 所述交联剂在本发明的一种实施方式中是戊二醛。
[0033] 所述得到的固定化细胞可采用湿法造粒并挤压成型后烘干至恒重，或者采用真空 冷冻干燥得到固定化细胞颗粒。
[0034] 本发明还提供一种利用所述固定化方法得到的固定化细胞生产乳果糖的方法，是 (1)将乳糖用缓冲液配制成50-800g/L，调节pH至6. 0-10. 0作为底物溶液；（2)将固定化 细胞加入底物溶液，转化条件为：固定化细胞的加酶量为〇. l-l〇〇U/mL，初始pH6. 0-10. 0， 反应温度为40-95°C，反应时间为0. l_12h。
[0035] 所用的缓冲液为：Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na2HPO 4-柠檬酸 缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液以及水溶液中的一种。
[0036] 在本发明的一种实施方式中，固定化酶的加酶量为12. 5U/mL，初始pH7. 5,反应温 度为75°C，反应时间为0_5h。
[0037] 本发明以异源表达纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)作为 生产菌株，发酵培养获得含纤维二糖差向异构酶的菌体细胞，将细胞经透化处理后，以壳聚 糖和三聚磷酸钠作为载体，添加交联剂，采用先絮凝包埋然后交联的方法絮凝固定化产纤 维二糖差向异构酶细胞，絮凝产物经湿法造粒，挤压成型后真空冷冻干燥或者烘干得到固 定化细胞颗粒。
[0038] 本发明中壳聚糖和三聚磷酸钠（TPP)的浓度选择很重要，只有在合适的浓度以及 壳聚糖与TPP的比例条件下，壳聚糖和TPP才不会形成均相体系，而是通过絮凝沉淀实现对 细胞的固定化。目前现有的细胞固定化技术有采用壳聚糖对细胞进行絮凝固定化的报道， 但是该方法不能完全将细胞絮凝下来，导致最终酶的固定化效率偏低，而另一种方法采用 壳聚糖与TPP形成均相体系包裹细胞，经过喷雾干燥得到固定化颗粒，但是该方法不适宜 大批量生产，而且得到的固定化酶酶活偏低。本发明首先采用壳聚糖作为阳离子絮凝剂与 细胞进行絮凝，然后添加一定浓度的三聚磷酸钠（TPP)作为阴离子絮凝剂，在合适的浓度 下，壳聚糖和TPP不会形成均相体系，能很好的达到絮凝固定化效果，固定化效率可达90% 以上。
[0039] 此外，本发明中对产酶细胞的前处理的选择也很重要。如果直接对胞内酶细胞进 行固定化，由于存在细胞膜的阻碍作用，降低底物与酶蛋白的亲和性，会导致固定化酶的酶 活偏低，加大固定化酶的使用量，而且还会导致反应效率偏低，反应所需的时间增加等。通 过对细胞的透性化前处理，细胞膜穿孔或者部分破碎，有利于底物与酶蛋白的接触，能很好 的解决直接固定细胞的缺陷。
[0040] 本发明的有益效果：（1)首次实现对纤维二糖差向异构酶的固定化，同时采用直 接固定化细胞的方法，有效避免了胞内酶在破碎、提取以及分离纯化过程中的酶活损失，而 且制备的固定化酶较游离酶热稳定性以及PH稳定性均增强，同时固定化酶能够回收重复 使用，酶活最高可达400U/g，回收率可达95%以上，降低了生产成本，为工业上酶法连续化 生产乳果糖提供有益的参考和借鉴；（2)通过絮凝包埋、戊二醛交联的方法制备固定化细 胞，操作过程简单，后续分离纯化相对简单且能耗小，有利于实现资源节约型、环境友好型 生产，为促进洁净、高效、环保的酶法生产乳果糖的工业化生产提供有益的借鉴。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1 :固定化酶与游离酶最适pH ;
[0042] 图2 :固定化酶与游离酶最适反应温度；
[0043] 图3 :固定化细胞与游离酶热稳定性，（A.游离酶半衰期；B.固定化酶半衰期）；
[0044] 图4 :固定化酶转化乳糖生产乳果糖。
【具体实施方式】
[0045] HPLC法测定乳果糖：取反应液离心（8000-12000r/min，15-20min)，上清液过 0. 22-0. 45 μ m的微孔滤膜，滤液上样HPLC分析检测。HPLC条件：色谱仪：Waters209 ;色谱 柱：Lichrosorb3. 9X 150mm NH2柱；流动相：75% (v/v)乙腈/水溶液；流动相流速：lmL/ min ;温度：25°C ;检测器：R401示差折光检测器，进样量：10μ L。
[0046] 纤维二糖差向异构酶酶活的定义：在80°C，ρΗ7. 5, 50mM缓冲液，每分钟催化乳糖 生成1 μ mol乳果糖所需的酶量定义为1U，反应底物乳糖浓度为50g/L，反应时间20min。
[0047] 实施例1菌体制备
[0048] 以异源表达纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌作为菌种进行发酵培养，发酵培 养步骤如下：经活化、扩大培养至对数期OD6tltl = 0. 6时加入乳糖至终浓度为10g/L，25°C， 200r/min摇床培养20h，发酵培养至发酵液中菌体浓度达到0D_ = 5-10。
[0049] 所述菌株的构建方法：以一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程 菌（以E. coli BL21 (DE3)为宿主、以pET-28a(+)为表达载体，目的基因来源于 Caldicellulosiruptor saccharolyticus，目标基因的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所不）
[0050] 实施例2不经前处理的菌体的固定化
[0051] 对实施例1的菌株发酵生产纤维二糖差向异构酶得到的发酵液，收集菌体，冷冻 干燥后制备成菌粉，进行絮凝固定化，步骤如下：
[0052] (1)菌粉溶于缓冲液中，调节菌体浓度至细胞干重为lg/L，添加20 % (v/v)醋酸调 节pH至5.0,得到菌悬液；
[0053] (2)向发酵培养液中添加终浓度为0.5% (w/v)的硅藻土，混合均勻，即得到混合 溶液；
[0054] (3)将溶解在醋酸浓度为0. 25% (v/v)的醋酸溶液中的壳聚糖溶液加入到步骤 (2)所得的混合溶液中，使壳聚糖终浓度为0.02% (w/v);
[0055] (4)按与步骤（3)得到的体系1:1的体积比缓慢加入三聚磷酸钠（TPP)溶液，使得 最终体系中TPP浓度为0. 012 % (w/v)，混合均匀，静置使菌体絮凝，除去上清液，得到絮凝 物；
[0056] (5)向絮凝物中加入终浓度为0· 25% (v/v)的戊二醒，4_30°C下交联2h，弃去上 清液，用缓冲液洗涤2-3次，即得到固定化细胞。
[0057] 所制备的固定化细胞颗粒湿法造粒成型后经冷冻干燥或者30_40°C烘干至恒 重后，其酶活可达100_150U/g，酶活回收率在90%以上，601：下固定化酶的半衰期可达 80-100h。
[0058] 实施例3经热处理的菌体的固定化
[0059] 对实施例1的菌株发酵生产纤维二糖差向异构酶得到的发酵液，离心收集发酵液 细胞，60°C下热处理2h后，经冷冻干燥制备冻干菌粉，对冻干菌粉进行絮凝固定化，步骤如 下：
[0060] (1)将游离细胞重悬于缓冲液中，调节菌体细胞至细胞干重的浓度为1.0% (w/ V)，用20% (v/v)醋酸调节pH至5. 0,得到菌悬液；
[0061] (2)向步骤⑴的菌悬液中加入终浓度0. 5% (w/v)的硅藻土，混合均勻，得到混 合溶液；
[0062] (3)将溶解在醋酸浓度为0. 25% (v/v)的醋酸溶液中的壳聚糖溶液加入到步骤 (2)所得的混合溶液中，使壳聚糖终浓度为0.02% (w/v);
[0063] (4)按与步骤（3)得到的体系1:1的体积比缓慢加入三聚磷酸钠（TPP)溶液，使得 最终体系中TPP浓度为0. 012 % (w/v)，混合均匀，静置使菌体絮凝，除去上清液，得到絮凝 物；
[0064] (5)向絮凝物中加入终浓度0· 25% (v/v)戊二醛，4-30°C下交联2h，弃去上清液， 用缓冲液洗涤2-3次，即得到固定化细胞。
[0065] 所制备的固定化细胞颗粒湿法造粒成型后经冷冻干燥或者30_40°C条件下烘干至 恒重后，酶活可达100_200U/g，酶活回收率在90%以上，60°C下固定化酶的半衰期可达到 80-100h。
[0066] 实施例4经透化处理的菌体的固定化
[0067] 对实施例1的菌株发酵生产纤维二糖差向异构酶得到的发酵液，离心收集发酵液 细胞，对细胞进行透化处理后，经冷冻干燥制备冻干菌粉，再进行后续固定化操作，步骤如 下：
[0068] (1)将透化细胞冻干菌粉重悬于缓冲液中，调节菌粉浓度为L 0% (w/v)，用20% (v/v)醋酸调节pH至5. 0,得到菌悬液；
[0069] (2)向步骤⑴的菌悬液中加入终浓度0. 5% (w/v)的硅藻土，混合均勻，得到混 合溶液；
[0070] (3)将溶解在醋酸浓度为0· 25% (v/v)醋酸溶液中的壳聚糖溶液加入到步骤（2) 所得的菌悬液中，壳聚糖终浓度为0.02% (w/v);
[0071] (4)按与步骤（3)得到的体系1:1的体积比缓慢加入三聚磷酸钠（TPP)溶液，使得 最终体系中TPP浓度为0. 012 % (w/v)，混合均匀，静置使菌体絮凝，除去上清液，得到絮凝 物；
[0072] (5)向絮凝物中加入终浓度为0.25% (v/v)戊二醛，4_30°C下交联2h，弃去上清 液，用缓冲液洗涤2-3次，即得到固定化细胞。
[0073] 所制备的固定化细胞颗粒湿法造粒成型后经冷冻干燥或者30_40°C条件下烘干至 恒重后，其酶活可达200-400U/g，酶活回收率在90%以上，最高可达95%。60°C下固定化酶 的半衰期可达到80-100h，虽然经透化处理的细胞，细胞膜发生了穿孔或破碎，酶蛋白直接 与反应体系接触，但采用本发明的固定化方法，半衰期与不经透化处理的固定化细胞相当。
[0074] 从图1可以看出：与游离酶相比，本方法得到的固定化酶的最适pH由7. 5变为 7. 0,有利于避免碱性条件下乳糖直接化学异构化生成副产物，同时可以节约碱性试剂。
[0075] 从图2可以看出：与游离酶相比，固定化酶的最适反应温度由80°C变为75°C，有助 于节约工业化生产乳果糖的能耗，同时在60°C下固定化酶的相对酶活仍可达到60%以上， 而游离酶仅为30 %左右。
[0076] 从图3可以看出：固定化酶的热稳定性较游离酶有很明显的提高。75°C下游离酶 的半衰期为3. 5h，而本方法制备的固定化酶在75°C下处理3. 5h还能保持82%的相对酶活。 60°C下，游离酶的半衰期仅为24h，而固定化酶的半衰期最高可达100h，提高了 5倍，有助于 实现工业化酶法连续生产乳果糖。
[0077] 实施例5固定化酶的应用
[0078] 将实施例4制备的固定化酶用于催化乳糖生产乳果糖：
[0079] (1)将乳糖用缓冲液配制成600g/L，调节pH至7. 5作为底物溶液；
[0080] (2)将固定化酶加入底物溶液，固定化酶的加酶量为12. 5U/mL，初始pH7. 5,反应 温度为75°C，反应时间为0_5h。
[0081] 所用的缓冲液为：TriS-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na2HP04-柠檬 酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液以及水溶液中的一种，调节pH至 7. 5。
[0082] 如图4所示，当体系缓冲液为Tris-HCl缓冲液（pH7. 5)时，反应温度75°C，固定 化酶加酶量为12. 5U/mL，反应2h时，反应液中乳果糖含量为358. 4g/L，乳果糖转化率达到 59. 7%，乳果糖的生产效率达到179. 2gAL · h)，反应5h时，乳果糖含量为402g/L。
[0083] 如图4所示，当体系缓冲液为磷酸盐缓冲液（pH7. 5)时，反应温度75°C，固定化 酶加酶量为12. 5U/mL，反应2h时，反应液中乳果糖含量为394. 7g/L，乳果糖转化率达到 65. 6%，乳果糖的生产效率达到197. 4gAL 4)。从图4还可以看出使用磷酸盐缓冲液的生 产效率比Tris-HCl更高，反应3h后，乳果糖含量基本不再增加，达到410g/L。
[0084] 实施例6
[0085] 对实施例1的菌株发酵生产纤维二糖差向异构酶得到的发酵液，离心收集发酵液 细胞，对细胞进行透化处理后，经冷冻干燥制备冻干菌粉，再进行后续固定化操作，步骤如 下：
[0086] (1)将透化细胞冻干菌粉重悬于缓冲液中，调节菌粉浓度为1. 0% (w/v)，用20% (v/v)醋酸调节pH至5. 0,得到菌悬液；
[0087] (2)向步骤⑴的菌悬液中加入终浓度0. 5% (w/v)的硅藻土，混合均勻，得到混 合溶液；
[0088] (3)将溶解在醋酸浓度为0. 25% (v/v)醋酸溶液中的壳聚糖溶液加入到步骤（2) 所得的菌悬液中，壳聚糖终浓度为0.5% (w/v);
[0089] (4)按与步骤（3)得到的体系1:1的体积比缓慢加入三聚磷酸钠（TPP)溶液，使得 最终体系中TPP浓度为0. 012% (w/v)，混合均匀，此时体系形成均相体系，无法得到絮凝产 物，只能通过喷雾干燥或者是冷冻干燥的方法得到固定化细胞，生产成本高，不适宜大批量 制备固定化酶。
[0090] 实施例7
[0091] 对实施例1的菌株发酵生产纤维二糖差向异构酶得到的发酵液，离心收集发酵液 细胞，对细胞进行透化处理后，经冷冻干燥制备冻干菌粉，再进行后续固定化操作，步骤如 下：
[0092] (1)将透化细胞冻干菌粉重悬于缓冲液中，调节菌粉浓度为L 0% (w/v)，用20% (v/v)醋酸调节pH至5. 0,得到菌悬液；
[0093] (2)向步骤（1)的菌悬液中加入终浓度0· 5% (w/v)的硅藻土，混合均匀，得到混 合溶液；
[0094] (3)将溶解在醋酸浓度为0· 25% (v/v)醋酸溶液中的壳聚糖溶液加入到步骤（2) 所得的菌悬液中，壳聚糖终浓度为0.02% (w/v);
[0095] (4)按与步骤（3)得到的体系1:1的体积比缓慢加入三聚磷酸钠（TPP)溶液，使得 最终体系中TPP浓度为0. 006% (w/v)，混合均匀，此时体系得到絮凝产物，但是酶活回收率 仅为70 %左右。
[0096] 实施例8细胞透化处理方法
[0097] 将实施例1的菌株发酵生产纤维二糖差向异构酶得到的发酵液，离心后收集菌 体，菌体悬浮于透化试剂溶液中使溶液中菌体浓度为细胞干重在0. l-50g/L，4-30°C下混匀 5-120min进行透化处理，离心收集沉淀，即得到透化细胞。
[0098] 所述透化试剂溶液是以下任意一种或者多种的混合：1-90% (v/v)的乙醇、 0· 1-5% (v/v)的甲苯、0.01-5% (w/v)的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)或者0· 1-5% (v/ v)异戊醇。
[0099] 实施例9固定化方法
[0100] 纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法通过以下步骤进行：
[0101] (1)从发酵液中收集菌体，用0.1 %异戊醇溶液进行透化处理。调节经透化处理过 的菌体细胞浓度至每IOOmL溶液中含有干重为0. Ig的细胞，调节pH至8. 0,形成菌悬液；
[0102] (2)向步骤⑴的菌悬液中每IOOmL加入I. Og的珍珠岩，混合均勻，形成混合溶 液；
[0103] (3)将壳聚糖溶液加入到步骤⑵所得的混合溶液中，使得到的体系中每IOOmL溶 液中含有壳聚糖的质量为〇. Olg ;
[0104] (4)缓慢加入TPP溶液到步骤3得到的溶液中，使最终体系中每IOOmL溶液中含有 TPP质量为0. Olg，混合均匀，菌体絮凝后，弃去上清液，得到絮凝物。
[0105] (5)向絮凝物中加入终浓度为0· 25% (v/v) 1，5-二氟-2, 4-二硝基苯，4-30°C下 交联2h，弃去上清液，用缓冲液洗涤2-3次，即得到固定化细胞。
[0106] 所述得到的固定化细胞采用湿法造粒并挤压成型后烘干至恒重，或者采用真空冷 冻干燥得到固定化细胞颗粒。酶活可达20?40U/g，酶活回收率在80 %，主要是因为前期 加入细胞量少，助滤剂质量多，故总酶量少，单位质量酶活相对低。
[0107] 实施例10固定化方法
[0108] 纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法通过以下步骤进行：
[0109] (1)将经50%乙醇透化处理后的细胞制备成冻干菌粉，悬浮于水中，调节菌体细 胞浓度至每IOOmL溶液中含有干重为5. Og的细胞，调节pH至3. 0,形成菌悬液；
[0110] (2)向步骤⑴的菌悬液中每IOOmL加入0. Ig的助滤剂，混合均勻，形成混合溶 液；
[0111] ⑶将壳聚糖溶液加入到步骤⑵所得的混合溶液中，使得到的体系中每IOOmL溶 液中含有壳聚糖的质量为Ig ;
[0112] (4)缓慢加入TPP溶液到步骤3得到的溶液中，使最终体系中每IOOmL溶液中含有 TPP质量为lg，混合均匀，静置使菌体絮凝，弃去上清液，即得到固定化细胞。
[0113] 所得到的固定化细胞制成固定化细胞颗粒后,其酶活可达300U/g，酶活回收率为 50%，主要是因为加入的酶量相对较大，而助滤剂比例小，影响了酶活回收率。
[0114] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，其特征在于，是将产纤维二糖差向 异构酶的全细胞经透化处理后，加入助滤剂、壳聚糖和三聚磷酸钠（TPP)，待菌体絮凝后，弃 去上清液，即得固定化细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透化处理，是指将产纤维二糖差向异 构酶的细胞悬浮于透化试剂溶液中，使细胞终浓度为每IOOmL溶液中含有干重为0. 01-5g 的细胞，于4-30°C下混匀5-120min处理，即得到透化细胞。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述透化试剂溶液是以下任意一种或者 多种的混合：以每IOOmL溶液中的终浓度来计，含有l-90mL的乙醇或0. l-5mL的甲苯或 0. 01-5g的十六烷基三甲基溴化铵或0. l-5mL的异戊醇。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化方法具体是在经透化处理过 的细胞干重为〇. 〇l_5g每IOOmL的细胞菌悬液中加入助滤剂混合均匀后，再加入壳聚糖溶 液使每IOOmL溶液中含有壳聚糖为0. 01-lg，再加入TPP溶液使每IOOmL溶液中含有TPP为 0. 01-lg，菌体絮凝后，弃去上清液，即得到固定化细胞。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固定化方法的步骤为：（1)调节经 透化处理过的菌体细胞浓度至每IOOmL溶液中含有干重为0. 1-5. Og的细胞，调节pH至 3. 0-8. 0,形成菌悬液；(2)向步骤1的菌悬液中每IOOmL加入0. 1-1. Og的助滤剂，混合均 匀，形成混合溶液；(3)将壳聚糖溶液加入到步骤2所得的混合溶液中，使体系中每IOOmL 溶液中含有壳聚糖质量为〇. Ol-Ig ; (4)加入TPP溶液到步骤3得到的溶液中，使得最终体 系中IOOmL溶液中TPP质量为0. 01-lg，混合均匀，待菌体絮凝后，弃去上清液，即得到固定 化细胞。
6. 根据权利要求1-5任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述菌体絮凝后，向每 IOOmL弃去上清的菌体絮凝物中加入I-IOOmL交联剂体积分数为0-2. 5%的交联剂溶液，于 4-30°C下交联0_5h，弃去上清液，得到固定化细胞。
7. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述菌悬液是发酵液离心收集的菌体 经透化处理后直接悬浮或者制备成菌粉后再悬浮于缓冲液中。
8. 根据权利要求1或4或5任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述得到的固定化 细胞挤压成型后于20-50°C下烘干或者冷冻干燥得到固定化细胞颗粒。
9. 一种根据权利要求1所述方法得到的固定化细胞。
10. -种利用权利要求8所述固定化细胞颗粒生产乳果糖的方法，是（1)将乳糖用缓冲 液配制成50-800g/L，调节pH至6. 0-10作为底物溶液；（2)将固定化细胞加入底物溶液，转 化条件为：固定化细胞的加酶量为0. l-l〇〇U/mL，初始pH6. 0-10. 0,反应温度为40-95°C，反 应时间为〇. l_12h。
【文档编号】C12R1/19GK104313009SQ201410561623
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】杨瑞金, 汪明明, 华霄, 沈秋云, 张文斌, 赵伟 申请人:江南大学