β-井冈霉烯胺的生物制备方法
【专利摘要】本发明公开了β-井冈霉烯胺的生物制备方法，是以式II所示的井冈霉烯酮为底物，使其在氨基转移酶的作用下，与氨基供体发生反应，生成式I所示的β-井冈霉烯胺，其反应路线如下：或是将氨基转移酶基因整合入井冈霉素生产菌株，使整合后的井冈霉素生产菌株通过发酵产生β-井冈霉烯胺。本发明的有益效果在于：解决了制备β-井冈霉烯胺的常规方法所产生的缺陷；基于由氨基转移酶催化的氨基转移反应，建立方便、高效、立体选择性强的β-井冈酶烯胺直接生物合成策略，为β型糖苷酶功能异常引起的相关疾病的药物开发提供直接的药物先导化合物。
【专利说明】β-井冈霉烯胺的生物制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及采用酶学、基因工程等生命科学技术手段，具体涉及一种β_井冈霉 烯胺的生物制备方法
【背景技术】
[0002] β -井冈霉烯胺（β-valienamine)是井冈霉烯胺的1-差向异构体，和井冈霉烯 胺一起被认为是糖苷酶抑制剂开发的先导化合物。由Ogawa和Suzuki研究团队开发的其 衍生物对N-辛烧基-β-井同霉烯胺（NOV)和N-辛烧基-4-epi_i3-井同霉烯胺（NOEV) β_类糖苷酶有抑制作用，有望作为药物分子伴侣应用于由β_类糖苷水解酶功能异常引 起的Gm-神经节苷脂C积症、Morquio B症以及Gaucher症等溶酶体I&积症（lysosomal storage disease, LSD)。天然状态下井冈霉烯胺以α-状态存在于井冈霉素、阿卡波糖等 结构中，可以通过井网霉素微生物裂解来获得，尚未见天然产物中β-井网霉烯胺结构单 元及其合成途径的报道，目前仅见于化学合成。
[0003] 目前，化学合成β -井冈霉烯胺的方法一般是以D-葡萄糖和L-山梨糖为起始原 料化学合成光学纯β_井网霉烯胺，需要经过复杂的保护、取代、消除、异构、脱保护及消旋 和手性拆分过程，相对于生物方法反应条件严苛，需要使用昂贵的立体选择催化剂，且消旋 体拆分困难。且这种总体合成方法因为合成反应需要至少10个反应步骤而过于复杂，因此 不能被采用进行大量生产。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供β -井R霉烯胺的生物制备方法，以解决现有技术中所存 在的上述问题。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] -方面，本发明提供了一种制备井R霉烯胺的方法，是以式II所示的井冈霉 烯酮为底物，使其在氨基转移酶的作用下，与氨基供体发生反应，生成式I所示的β -井冈 霉烯胺，其反应路线如下：
[0007]
【权利要求】
1. 一种制备β-井R霉烯胺的方法，其特征在于， OH 以井闪霉烯酮JT1为底物，使其在氨基转移酶的作用下，与氨基供体发生反 A _ 应，生成β-井R霉烯胺 Λ〇
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下操作： 将所述井冈霉烯酮、氨基供体、氨基转移酶和辅因子在PH为7.O?7. 5的缓冲液中，在 25?37°C下进行反应，得到所述β-井R霉烯胺。
3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基供体为L-谷氨酰胺、L-谷氨 酸盐、L-丙氨酸或L-丝氨酸；所述辅因子为磷酸吡哆醛。
4. 如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述氨基转移酶包括天然氨基转移 酶或在所述天然氨基转移酶基础上经蛋白质工程技术手段进行改造的氨基转移酶的突变 体。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述天然氨基转移酶来源于天冬氨酸 氨基转移酶I家族、Pfam数据库DegT_DnrJ_EryCII_StrC氨基转移酶亚家族。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氨基转移酶包括来自于各种微生 物的BtrR、ArnB,DesI、Per、PglE、PseC、DesV、MegCII、TylB、QdtB、WbpE、WecE、GtmB、RbmB、 StsC、SpcS2、TbmB或其他来自于抗生素结构中负责催化该结构生成的氨基转移酶。
7. -种制备β_井R霉烯胺的方法，其特征在于，是将氨基转移酶基因导入井R霉素 生产菌株，采用获得的基因工程菌通过发酵产生β_井R霉烯胺。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述将氨基转移酶基因导入井R霉素 生产菌株的方法为采用整合型质粒通过链霉菌接合转移操作，将氨基转移酶基因整合入宿 主染色体上。
9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述生产井R霉素的菌株包括在天然 生产菌株的基础上采用生物工程手段改造的突变菌株。
10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述生产井网霉素的菌株为吸链霉菌 井冈变种5008或吸水链霉菌柠檬亚种。
【文档编号】C12R1/55GK104313069SQ201410568317
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】冯雁, 崔莉, 白林泉, 邓子新, 关晓青 申请人:上海交通大学