一种重组细胞系、其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了一种重组细胞系、其制备方法和应用。本发明提供的重组细胞系OP9-lhx2为在骨髓基质细胞OP9中导入表达Lhx2的基因，实现过表达Lhx2，该细胞系为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞提供了必要的微环境，成功诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞，显著提高了诱导效率，为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向血液细胞分化提供了新的方法。
【专利说明】一种重组细胞系、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种重组细胞系、其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]细胞疗法为一些遗传性疾病、恶性疾病的治疗带来了新的希望，细胞替代治疗是细胞疗法中的一种。目前临床上最常用的细胞替代治疗手段是造血干细胞在血液遗传性疾病(如再生障碍性贫血)及恶性白血病中的应用，这需要合适的造血干细胞，所以，造血干细胞的来源成为了该技术推广与应用的技术难题。
[0003]目前，骨髓、被激活的外周血及脐带血为主要的造血干细胞来源，这些来源的造血干细胞数量少，体外扩增能力有限，且异体移植配型困难也严重限制了该方法的应用。根据研究报道，通过诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞可以定向分化为造血干细胞在内的血液细胞，在适当条件下可进一步分化称为各种血细胞。
[0004]目前诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞的方法主要有三种:
(I)主要通过体外形成拟胚体(EB)，然后在成分确定的无血清培养基中培养，之后结合可溶性因子诱导获得；(2)主要通过体外多能干细胞和/或胚胎干细胞与造血微环境基质细胞的共培养获得造血干细胞；(3)主要通过体内注射多能干细胞和/或胚胎干细胞形成畸胎瘤方法来产生造血干细胞。
[0005]研究报道，通过拟胚体形成的中胚层细胞与0P9细胞(小鼠骨髓基质细胞)共培养可以获得造血祖细胞，但没有获得造血干细胞。无血清培养拟胚体时，通过加入造血发育相关细胞因子来时续性诱导，可以分化成血管内皮细胞，经0P9衍生细胞系0P9-DL1和0P9-DL4细胞共培养可获得含分化为淋系在内的永久造血前体细胞。
[0006]2013年，首次报导了从畸胎瘤中分离到具有重构造血功能的造血干细胞，之后通过基因修饰的iPS细胞(Lnk-/-)结合环境细胞0P9以及造血关键因子SCF、TPO组合方式可以直接在体内畸胎瘤中产生造血干细胞，并能通过新生血管迁移到受体鼠的骨髓。分离这些细胞做移植可重构造血系统。借用畸胎瘤体内造血技术，注射非基因修饰ES和人iPS一样也可以获得功能性造血干细胞，这是目前公认的从多能干细胞和/或胚胎干细胞诱导产生功能性造血干细胞，进而获得血液细胞的唯一途径。但是，该方法效率极低，而且相关报道能否重复未知，所以，还需要不断的科学研究来寻求新的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的发明目的在于提供一种重组细胞系、其制备方法和应用。本发明提供的重组细胞系可用于诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化，显著提高了诱导效率。
[0008]本发明提供的一种重组细胞系0P9_lhx2细胞系，为在骨髓基质细胞0P9细胞中导入Lhx2的基因并过表达Lhx2。
[0009]骨髓基质细胞为(bone marrow stromal cells,BMSCs)是造血微环境的重要组成成分，可以分泌多种与造血有关的正负调控因子，发挥调控造血的作用。在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组细胞系中所用的骨髓基质细胞为0P9细胞。
[0010]Lhx2是LIM同源结构域(LIM homeodomain,简称LIM-HD)转录因子家族中的一员，在多个系统中发挥着重要作用，影响机体的生长与发育。在本发明中Lhx2的基因具有如NCBI ΝΜ_001290646所示的核苷酸序列。
[0011]本发明提供的重组细胞系在骨髓基质细胞0P9中导入了表达Lhx2的基因，实现了Lhx2过表达。该细胞系为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞提供了必要的微环境，成功诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞。
[0012]本发明还提供了所述重组细胞系的制备方法，包括:
[0013]通过病毒载体向骨髓基质细胞0P9中转染表达Lhx2的基因，即得。
[0014]优选地，本发明提供的制备方法中，所用的病毒载体为逆转录病毒载体。更为优选地，本发明提供的制备方法中，所用的逆转录病毒载体为PMYs系列逆转录病毒载体。
[0015]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法具体为:
[0016]获得表达Lhx2的DNA分子；
[0017]以pMYs-1RES载体为骨架，将所得表达Lhx2的DNA分子整合到pMYs_IRES载体中，获得重组病毒载体；
[0018]将重组病毒载体导入逆转录病毒包装细胞系进行包装，收集包装病毒上清液；
[0019]取所得包装病毒上清液，转染骨髓基质细胞。
[0020]本发明所述制备细胞系的方法，经检测阳性率达90%以上。
[0021]本发明提供的制备方法以逆转录病毒载体介导表达Lhx2的基因导入骨髓基质细胞0P9中，获得了过表达Lhx2的重组细胞系，在所得骨髓基质细胞中导入表达Lhx2的基因。
[0022]本发明还提供了重组细胞系在诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化中的应用。
[0023]在本发明中，本发明提供的重组细胞系能够为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞提供必要的微环境，成功诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞，包括造血干细胞。
[0024]在本发明的一些实施例中，本发明提供的重组病毒载体中的病毒载体为逆转录病毒载体。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组病毒载体中的逆转录病毒载体为PMYs系列逆转录病毒载体。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的重组病毒载体具体为 pMYs-1RES-GFP。
[0025]本发明还提供了一种利用所述重组细胞系体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，该方法包括:
[0026]取该骨髓基质细胞与多能干细胞和/或胚胎干细胞共培养。
[0027]本发明提供的利用重组细胞系诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，实现了在体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞定向分化。
[0028]在本发明的一些实施例中，本发明提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，具体为:
[0029]取骨髓基质细胞，贴壁生长后，接种多能干细胞和/或胚胎干细胞至所述骨髓基质细胞上，共培养5天?13天，收集并富集CD34+细胞；取所得CD34+细胞接种于新的所述骨髓基质细胞上，培养5天?13天，收集细胞。
[0030]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法中，接种多能干细胞和/或胚胎干细胞的步骤，具体为:
[0031]取多能干细胞和/或胚胎干细胞，用Dispase酶消化多能干细胞和/或胚胎干细胞，收集多能干细胞和/或胚胎干细胞，稀释得多能干细胞和/或胚胎干细胞悬浮液；将所得多能干细胞和/或胚胎干细胞悬浮液加到贴壁生长后所得的骨髓基质细胞上。
[0032]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法中，收集并富集CD34+细胞的步骤，具体为:
[0033]取共培养7天?9天所得细胞，消化成单细胞后，用⑶34免疫磁珠吸附、分离⑶34+细胞，富集⑶34+细胞。
[0034]本发明还提供了一种利用所述重组细胞系诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，包括:
[0035]将该骨髓基质细胞与多能干细胞和/或胚胎干细胞共注射受体动物皮下或睾丸中，培养，形成畸胎瘤。
[0036]优选地，本发明提供的利用重组细胞系诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，在共注射之后，还包括:
[0037]持续补充细胞因子SCF、细胞因子TPO的步骤。
[0038]在本发明的一些实施例中，本发明提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法中，持续补充细胞因子SCF、细胞因子TPO的方法为:
[0039]在小鼠背部植入带有细胞因子SCF、细胞因子TPO的释放泵。
[0040]在本发明的一些实施例中，本发明提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法中受体动物为免疫缺陷小鼠。
[0041]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，具体为:
[0042]取免疫缺陷小鼠，以左右腹股沟为注射点，分别向每个注射点注射多能干细胞和/或胚胎干细胞和本发明提供的骨髓基质细胞；之后在免疫缺陷小鼠的背部植入带有细胞因子SCF、细胞因子TPO的缓释泵；
[0043]在所述小鼠饲养期间，每3周向缓释泵中补充一次细胞因子SCF、细胞因子ΤΡ0。
[0044]本发明提供的利用所述重组细胞系诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，通过形成畸胎瘤，实现了诱导体内诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞的分化。实验结果证明，本发明提供的方法显著提高了诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向造血干细胞定向分化的诱导效率。
[0045]本发明提供了一种重组细胞系、其制备方法和应用。本发明提供的重组细胞系为在骨髓基质细胞0P9中导入表达Lhx2的基因。该细胞系为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液提供了必要的微环境，成功诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞。
[0046]实验结果证实，通过多能干细胞和/或胚胎干细胞与本发明提供的重组细胞系共培养，实现了体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞；体内实验中，多能干细胞和/或胚胎干细胞与本发明提供的重组细胞系共同注射受体动物体内，通过畸胎瘤造血产生造血细胞及成熟血液细胞，并且显著提高了诱导效率，体外提高了多能干细胞向造血细胞分化的效率达一倍以上，体内提高了畸胎瘤途径获取造血干细胞的效率达6倍以上，为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向造血细胞分化提供了新的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1示实施例1制备获得的0P9_lhx2细胞系的构建及鉴定。
[0048]图2示0P9_lhx2细胞系体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞的检测结果；
[0049]图3示0P9_lhx2细胞系体内诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞的检测结果。
【具体实施方式】
[0050]本发明公开了一种重组细胞系、其制备方法和应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该重组细胞系，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0051]本发明提供的一种重组细胞系、其制备方法和应用中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
[0052]为了使本【技术领域】的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0053]实施例1重组细胞系的制备
[0054]以商业化的pMYs-1RES-GFP载体为骨架，将lhx2cDNA阅读框亚克隆方式插入，构建pMYs-Lhx2-1RES-GFP载体，Lhx2基因的核苷酸序列信息见(NM_001290646)，本申请所用的序列与公开的序列一致。载体经酶切、测序鉴定正确后利用去内毒素的质粒抽提试剂盒抽提足够量的pMYs-Lhx2-1RES-GFP质粒。用经典钙转法将pMYs-Lhx2-1RES_GFP质粒导入Plat-E包装细胞，48-72小时收集包装病毒上清。包装病毒上清随后感染0P9细胞系。感染48小时后，细胞GFP阳性率高达90%以上，无需对细胞进行进一步的纯化。利用Real-timeqPCR及Western Blot进行鉴定lhx2在0P9细胞中的过表达情况。图1示0P9_lhx2细胞系的构建及鉴定；(A) lhx2感染小鼠骨髓后可以建立SCF依赖的细胞系；(B)过表达基因会伴随表达GFP，发出绿色荧光，表明细胞感染率理想；(C)荧光定量PCR表明lhx2在0P9中高表达；(D)Western鉴定lhx2蛋白在op9_lhx2细胞系中高表达。
[0055]实施例2体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化血液细胞
[0056]按实施例1方法制备0P9_Lhx2细胞，平铺在培养板中，置于37°C、5% C02的细胞培养箱中，过夜贴壁生长，所用培养基为80% α-ΜΕΜ，20%胎牛血清；在细胞密度达到100%融合前，用25%的胰酶消化，传代培养，备用，为实验组。以0P9-GFP细胞作为对照组。
[0057]取0P9_Lhx2细胞平铺在10mm培养皿中，细胞过夜贴壁，待细胞接近长满；将0P9-Lhx2细胞系的培养基换成分化培养基，备用。
[0058]取人胚胎干细胞系Hl培养于6孔板内，消化前将人胚胎干细胞培养基吸走，清洗细胞两遍，再加入2mg/mL Dispase消化液,在37°C条件下消化5分钟后吸走Dispase消化液，用DMEM/F12清洗一遍后，再加入DMEM/F12，并用ImL的枪头将培养皿中的人胚胎干细胞克隆刮碎成小克隆，并转移至15mL竖直放置的15mL离心管内，待其自然沉降1mL后，吸走离心管上方的上清，并加入对应体积的人胚胎干细胞培养基(一块6孔板的人胚胎干细胞加入3mL培养基)，向准备好的每一个10mm培养皿的0P9_Lhx2细胞系中加入ImL人胚胎干细胞细胞悬液。进行共培养，细胞形态学上跟踪人胚胎干细胞的分化状态，在共培养5-9后天后，收集并富集CD34+细胞；具体方法为:消化成单细胞，并用CD34免疫磁珠吸附分离⑶34+细胞，将富集的⑶34+细胞以2 X 15/孔的密度接种到预先准备好的24孔板0P9_Lhx2细胞系上，并加入造血细胞因子SCF、细胞因子ΤΡ0，继续分化(约9-13天)，收集细胞，计数、进行流式分析。
[0059]流式细胞分析结果见图2，其中图2-A为流式分析图；图2-B为数据统计分析图，其中I代表对照组，即0P9-GFP细胞系诱导组；2代表实验组，即0P9-Lhx2细胞系诱导组。从图2-A可知，来自实验组的成熟血液细胞(⑶45+)及血液祖细胞(⑶45+⑶34+)的比例要高于对照组，差异显著(P <0.05)。从图2-B可知，无论是比例还是绝对数，实验组中血液细胞显著高于对照组，差异显著(P < 0.05)。说明本实施例转染了 Lhx2的0P9增强体外诱导胚胎干细胞向造血干细胞细胞分化，进而分化为各种血液细胞。
[0060]综上所述，利用本发明所述重组细胞系实现了在体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞或胚胎干细胞定向分化为血液细胞，为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞或胚胎干细胞定向分化为血液细胞提供了新的方法。
[0061]实施例3体内诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞
[0062]材料来源:
[0063]0P9-Lhx2细胞:按照实施例1提供的制备方法制备获得；
[0064]诱导方法:
[0065]取免疫缺陷小鼠(N0D-SCID，北京维通利华实验动物及技术有限公司)，每一只小鼠有两个畸胎瘤注射点，分别位于左右腹股沟处；每一个畸胎瘤注射点各注射4X 16人胚胎干细胞及1060P9-Lhx2细胞，注射体积为10uL,包括50uL Matrigel和50uL DPBS，注射一次；同时于该小鼠的背部植入一个带有200ng细胞因子hSCF和200ng细胞因子hTPO的缓释泵，每3周补充一次细胞因子；同时设立对照组，对照组所用细胞为0P9-GFP细胞。
[0066]在移植后8周处死小鼠；取0?9-^^2细胞与人胚胎干细胞共注射免疫缺陷小鼠形成的畸胎瘤，经过无菌物理剪碎、胰酶消化形成单细胞悬液。添加FcBlocker到单细胞悬液之中，封闭普通抗原表位，防止抗体非特异性结合。之后，将血液细胞特异性抗体CD45，以及鉴定造血干细胞的抗体⑶48，slamfl加入到单细胞悬液，流式检测移植鼠畸胎瘤与骨髓中的ES细胞来源的总血液细胞、造血干细胞及终末分化的各系血液细胞，实验结果见图3，从图中可知，0P9-Lhx2组的畸胎瘤中血液细胞(CD45+)占畸胎瘤总活细胞约0.03%。而来自0P9-lhx2组的畸胎瘤血液细胞中造血干细胞(CD48_Slamfr)的比例高达47%，显著高于对照组7%的比例，差异显著(P <0.05)。
[0067]多次重复实验，所得实验结果类似，说明本发明提供的骨髓基质细胞实现了体内诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞的分化，并且显著提高了多能干细胞和/或胚胎干细胞向造血干细胞的转化效率，为诱导胚胎干细胞或多能干细胞和/或胚胎干细胞向造血干细胞、血液细胞分化提供了一种新的方法。
[0068]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种重组细胞系，其特征在于，在骨髓基质细胞0P9细胞中导入Lhx2的基因并过表达 Lhx2。
2.一种如权利要求1所述重组细胞系的制备方法，其特征在于，包括: 通过病毒载体向骨髓基质细胞0P9中转染Lhx2基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述逆转录病毒载体为pMYs系列逆转录病毒载体。
5.根据权利要求2述的制备方法，其特征在于，具体为:以pMYs-1RES载体为骨架，将Lhx2cDNA阅读框亚克隆方式插入，构建pMYs-Lhx2-1RES载体，载体经酶切、测序鉴定正确导入包装细胞，收集包装病毒上清，感染0P9细胞系。
6.如权利要求1所述的重组细胞系在诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化中的应用。
7.一种利用如权利要求1所述的重组细胞系诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，其特征在于，包括: 取所述重组细胞系与多能干细胞和/或胚胎干细胞共培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体为: 所述重组细胞贴壁生长后，接种多能干细胞和/或胚胎干细胞至所述重组细胞上，共培养5天?13天，收集并富集⑶34+细胞；取所述⑶34+细胞再次接种于重组细胞，培养5天?13天,收集细胞。
9.一种利用如权利要求1所述的重组细胞系诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，其特征在于，包括: 将所述重组细胞系与多能干细胞和/或胚胎干细胞共注射受体动物皮下或睾丸中，培养，形成畸胎瘤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述共注射之后，还包括: 持续补充细胞因子SCF、细胞因子TPO的步骤。
【文档编号】C12N5/10GK104450622SQ201410570904
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】王金勇, 陈晓梨, 耿阳, 赵乾浩, 黄可 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院