一种甲基化dna的测序方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种甲基化DNA的测序方法及其应用。基于目前成熟的高通量测序(Next Generation Sequencing)技术，首次引入羟甲基化修饰的寡核苷酸接头，将DNA甲基化免疫共沉淀测序技术与亚硫酸氢盐处理测序技术相结合，从而将不含有甲基化修饰的DNA片段去除，即只对含有甲基化修饰的DNA片段进行亚硫酸盐处理，最终精确测定这些DNA片段上的甲基化修饰位点；该方法能够使测定全基因组水平的DNA甲基化修饰位点所需的数据量降至常规方法的1/10，从而降低测序成本和信息处理量，更高效地对全基因组DNA甲基化进行高通量测序。
【专利说明】一种甲基化DNA的测序方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种甲基化DNA的测序方法及其应用。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是表观遗传调控中的重要修饰之一，被称之为哺乳动物DNA中除ATCG 四种碱基以外的"第五种碱基"。在哺乳动物胚胎干细胞和大脑中它主要发生在CpG二核苷 酸中胞嘧啶苯环第五位碳原子上，少部分发生在CHG和CHH(H = A，T，C)上。作为一种共价 修饰，DNA甲基化在正常的分化发育和疾病发生中发挥重要作用，同时在更高等真核生物器 官的细胞分化中可以稳定遗传，并且在斑马鱼中发现它可以通过精子传给下一代。在细胞 分化、疾病和环境影响下，DAN甲基化状态会发生巨大变化。因此，5mC位点的检测以及DNA 甲基化水平的评估对发育和疾病发生中DNA甲基化状态的揭示显得尤为重要。
[0003] 由于2007年高通量测序技术的进步，一些基因组DNA甲基化检测技术也得到发 展。在单分子水平定量检测5mC方面，甲基化测序无疑是最强大和全面的一种方法。然而， 甲基化测序需要测到至少整个基因组30倍的测序深度，并且对于大样本大基因组的DNA甲 基化组的测定，是极其昂贵的。简化的代表性的重亚硫酸盐测序（RRBS)实现单碱基分辨率 方案，但是只描绘了覆盖整个基因组的5%并且局限于CpG岛（CGIs)的甲基化图谱。然而， 不同样本间的甲基化组分析表明大部分组织和癌症特定的差异甲基化区域发生在CpG岛 附近。甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq)实现了高达67 %的CpG的覆盖度，而RRBS 只覆盖了最少的基因组水平的CpGs (12% )。但是，MeDIP-seq不能实现单碱基分辨率，同 时也不能检测非CpG的甲基化状。
【发明内容】
[0004] 为了克服MeDIP-Seq和MethylC-Seq的缺陷但又综合两者的优势，我们将亚硫 酸盐处理整合到MeDIP-seq的方法中，组成定义为甲基化DNA免疫沉淀亚硫酸盐测序 (MB-seq)。
[0005] 由于在MeDIP方法中连接了甲基化接头的未甲基化的片段会被非特异的拉下，另 外未甲基化的11 Iumina测序接头中的胞啼陡在亚硫酸盐处理后也会被转化为尿啼陡，这 将导致接头连接的DNA片段不能匹配Illumina测序，因此在MB-seq中这些接头是不适用 的。基于羟甲基化的DNA片段不能被5mC抗体富集并且在亚硫酸处理过程中羟甲基化的胞 嘧啶与甲基化的胞嘧啶有同样的效果，我们创造性地将羟甲基化的接头（接头中所有的胞 嘧啶都是羟甲基化的）引入MB-seq中。
[0006] 具体而言，本发明提供了下述内容：
[0007] -种甲基化DNA的测序方法，包括建库步骤和测序步骤：
[0008] 其中建库步骤是指获得待检测的甲基化DNA文库的步骤，所述建库步骤包括：
[0009] 1)基因组DNA的片段化及双链DNA片段末端修复；
[0010] 2)将1)中得到的DNA片段与羟甲基化修饰的寡核苷酸接头连接；
[0011] 3)富集步骤2)中的甲基化DNA片段；
[0012] 4)将步骤3)中得到的产物中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基；
[0013] 5)将4)中的单链DNA通过引物进行扩增以获得双链DNA ;
[0014] 6)去除接头回收纯化DNA。
[0015] 其中测序步骤是指对前述建库步骤获得的文库进行序列测定，还包括如下步骤：
[0016] 7)对步骤6)中获得的双链DNA进行测序。
[0017] 其中建库步骤和测序步骤中，步骤1)包括：
[0018] a)将基因组DNA片段化成为DNA片段；
[0019] b)将所述DNA片段进行末端修复以获得具有平末端的DNA片段；
[0020] c)将2)中得到的DNA片段的3'末端加上A碱基；
[0021] 本发明中，所述羟甲基化修饰的寡核苷酸接头中所有的碱基胞嘧啶都是羟甲基化 的。
[0022] 本发明中，步骤3)中的富集羟甲基化DNA通过MeDIP技术进行的。
[0023] 本发明中，步骤4)中通过亚硫酸盐处理试剂盒将DNA中未甲基化的胞嘧啶碱基转 化为尿嘧啶碱基。
[0024] 本发明中，步骤5)中通过高保真DNA聚合酶将单链DNA进行扩增以获得双链DNA。
[0025] 本发明中，步骤6)中用胶回收试剂盒通过凝胶电泳回收纯化的DNA。
[0026] 本发明还提供了所述方法构建得到的DNA测序文库。
[0027] 本发明中还提供了一种试剂盒，其中至少包含用于DNA末端修复的试剂，DNA 3' 端加 A的试剂，羟甲基化修饰的接头试剂、通过MeDIP技术富集甲基化DNA的试剂，用于将 未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐试剂，用于扩增的试剂，用于胶回收的试剂。 其中，所述扩增的试剂包括引物。
[0028] 本发明还包括所述试剂盒用于甲基化DNA文库建库或者用于甲基化DNA测序的用 途。
[0029] 本发明MB-seq能够精确地检测到单个5mC位点的甲基化水平并且基因组覆盖度 高。相对于甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq)准确性提高，无论是在测序深度还是 在测序质量评估方面，本技术都表现出明显的优势。同时，本技术在灵敏度与专一性方面 都能达到与全基因组亚硫酸盐测序技术相近的效果。相对于全基因组亚硫酸盐测序技术 (MethylC-seq)，所需数据量减少，仅需BS的1/10,成本下降。相对于简化的具有代表性的 亚硫酸盐测序（RRBS)，对基因组的覆盖度大幅提高。MB-seq的技术对于不同起始量的DNA 重复性好。在技术成本上，在功能区甲基化测序数据饱和的情况下可比全基因组亚硫酸氢 盐测序的数据量少90% -95%，节约每个样本检测成本80% -90%。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0031] 图1是各种DNA甲基化测序方法检测灵敏度的比较，包含MB-seq、MeDIP-seq、RRBS 及 MethylC-seq、；
[0032] 图 2 是 MB-seq 与 MeDIP-seq 建库流程；
[0033] 图3是MB-seq技术1微克DNA起始量与500纳克DNA起始量之间的技术重复性 相关系数；
[0034] 图4是MB-seq技术200纳克DNA起始量与50纳克DNA起始量之间的技术重复性 相关系数；
[0035] 图5是不同DNA甲基化测序方法（MB_seq、RRBS、MethylC_seq)不同测序深度下可 以覆盖的全基因组CpG的百分数；
[0036] 图6是不同DNA甲基化测序方法不同测序深度下可以覆盖的重复序列元件中CpG 的百分数；
[0037] 图7是三种亚硫酸盐测序（MB_seq、RRBS、MethylC_seq)检测到的mCpG重叠分析。
【具体实施方式】
[0038] 下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039] 实施例1 :
[0040] 试验用DNA来自通过SV40T/t抗原和人类端粒酶催化后永生化的人类卵巢上皮细 胞系（T29)。具体操作过程如下：
[0041] 1.获取基因组DNA
[0042] 取1'29细胞系，用0^^1^0嫩81〇〇(1&1188脱1(^(0丨38611公司）提取样品0嫩。 将提取得到的DNA编号为MB，取其中200纳克DNA样品作为起始材料，参照图2中MB-seq 的流程构建文库，本实施例中构建的是Illumina Hiseq 2000Paired End文库。
[0043] 2.片段化基因组DNA
[0044] 采用Covaris system(AB公司）将前述步骤1中的DNA样品进行断裂，样品断裂 结束后，将断裂后的样品在2%琼脂糖凝胶上进行IXTAE电泳检测，从所述电泳凝胶回收 待测DNA片段。为将样品DNA片段控制在100?250bp范围内，Covaris system断裂具体 操作为：
[0045] 1)双击打开 Covaris 主程序"SonoLAB S-Series V2. 54，'后点击"Start [Enter]，'， 待仪器排气30分钟，且水温降为TC左右后方可使用。打开主程序之前须先确定打碎仪和 冷却仪的电源开关是否打开，否则主程序会提示错误并重试。
[0046] 2)将样品加入待用的130ul的covaris micro Tube中，样品加入量5 μ g，最后将 终体积用TE缓冲液补至130μ 1，用移液器将样品溶液吹打混匀。点击"Configure"，设置参 数见表1 :
[0047] 表1片段化基因组DNA在Covaris system中的设置参数
[0048]
【权利要求】
1. 一种甲基化DNA的测序方法，其特征在于，包括如下步骤： 1. DNA样品的片段化； 2) 将1)中得到的DNA片段与羟甲基化修饰的寡核苷酸接头连接； 3) 富集步骤2)中的甲基化DNA片段； 4) 将步骤3)中得到的产物中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基； 5) 将4)中的单链DNA通过引物进行扩增以获得双链DNA ; 6) 去除接头回收纯化DNA ; 7) 对步骤6)中获得的双链DNA进行测序。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包括： a) 将基因组DNA片段化成为DNA片段； b) 将所述DNA片段进行末端修复以获得具有平末端的DNA片段； c) 将b)中得到的DNA片段的3'末端加上A碱基。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟甲基化修饰的寡核苷酸接头中所 有的碱基胞嘧啶都是羟甲基化的。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的富集羟甲基化DNA通过MeDIP 技术进行。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中通过亚硫酸盐处理试剂盒将 DNA中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中通过高保真DNA聚合酶将单链 DNA进行扩增以获得双链DNA。
7. 根据权利要求1所述方法构建得到的DNA测序文库。
8. -种试剂盒，其中至少包含所述用于DNA末端修复的试剂、DNA 3'端加A的试剂、羟 甲基化修饰的接头试剂、通过MeDIP技术富集甲基化DNA的试剂、用于将未甲基化的胞嘧啶 转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐试剂、用于扩增的试剂、用于胶回收的试剂。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，所述扩增的试剂包括引物。
10. 权利要求8的试剂盒用于建立甲基化DNA文库或者用于甲基化DNA测序的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104372079SQ201410578592
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】蔡万世, 伍鸿鹄, 王康利, 孙中生 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所