莫能菌素预混剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种莫能菌素预混剂的制备方法，具体为将肉桂地链霉菌菌种制备后先进行种子摇瓶培养和种子罐培养，当培养至种子龄为20～24h，培养液pH值为6.6～7.1，生物量为10％以上，镜检结果显示菌丝粗壮呈网状、舒展、染色深、无杂菌时，转为发酵培养。待残油量为0.7％以下，生物量在40％以上，菌丝浓度为40～50％，莫能菌素效价不低于40000u/mL时，发酵结束。最后采用一步喷雾干燥法进行莫能菌素的提取，所制得的莫能菌素成品含量为20％以上，颗粒率达75％以上。另外，该方法发酵工艺简单，能有效提高发酵单位，降低生产成本，同时避免了动物源性氮源以及化学有机溶剂的使用。
【专利说明】莫能菌素预混剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽药领域，涉及一种抗生素预混剂的制备方法，具体涉及莫能菌素预混剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]莫能菌素(monensin),属聚醚类抗生素,在1967年首先由Haney等人从肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)的发酵液中分离得到。20世纪70年代作为抗球虫药物开始投放市场。美国、日本分别于1974年、1977年正式批准将其作为饲料添加剂，我国于1985年获批，并应用于生产。目前已有40多个国家用作肉牛、肉羊的增重剂和猪的生长促进剂。莫能菌素对阴性菌无作用，但对葡萄球菌、杆菌、梭菌、链球菌、霉菌(青霉菌、念珠菌)有一定的抑制作用。莫能菌素可以影响反刍动物瘤胃内能量代谢，改善瘤胃发酵，提高丙酸与乙酸的产出比例，降低挥发性脂肪酸，减少甲烷生成，提高蛋白质利用效率。因此能够显著提高反刍动物的饲料利用率和促进生长的作用。
[0003]随着畜牧业的进一步发展，近年来莫能预混剂的市场需求量不断扩大，而国内外客户对莫能预混剂的质量要求越来越高，而现有的一些制备方法存在下述缺点:提取工艺复杂,化学溶剂消耗量大,从而产生大量的废溶剂和废渣,生产成本和环保成本较大；产品颗粒率较低，不利于莫能菌素在饲料中的分散；发酵培养过程中使用了国内外饲料行业中严格禁止使用的原料如鱼粉等，致使生产扩大化无法实现。有鉴于此，有必要对现有的莫能菌素预混剂的制备方法作进一步的改进。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种莫能菌素预混剂的制备方法，该方法采用一步喷雾干燥，提高了产品颗粒率。
[0005]本发明采用的具体技术方案如下:
[0006]莫能菌素预混剂的制备方法，包括以下步骤:
[0007]a.种子培养
[0008]将经过菌种制备得到的肉桂地链霉菌依次进行种子摇瓶培养和种子罐培养；所述种子摇瓶培养的培养条件为以220?260rpm的转速，在32±0.5°C条件下培养24?27h ；所述种子罐培养的接种量为0.0035%种子液；所述种子罐培养的培养条件为在温度为32 ± 0.5°C，罐压为0.02?0.05MPa条件下培养20?24h ；
[0009]所述种子摇瓶培养所需的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉I?1.5%，酵母粉0.1?0.3%，葡萄糖0.2?0.5%，糊精1.0?2.0%，碳酸钙0.05?0.1%,余量为水；培养基灭菌后pH值为6.9?7.1 ;
[0010]所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉1.0?1.5%，酵母粉0.1?0.25%，葡萄糖L 5?2.5%，碳酸钙0.1?0.25%，消泡剂0.05?
0.1%,余量为水；培养基灭菌后pH值为6.6?7.1 ;
[0011]b.发酵培养
[0012]将步骤a培养过后的含菌种的培养液转入发酵罐内进行发酵培养，发酵培养条件为:罐内温度34土1°C，溶氧量30%以上，罐压0.03?0.05MPa ;发酵过程中通过添加氨水溶液、植物油和无菌水，以使发酵液PH值维持在6.5?6.6之间，植物油按质量百分浓度计不低于3 %，溶氧量不低于30%，发酵过程结束前24?48小时停止加植物油；当发酵液pH值达6.6?7.0，残油量为0.7%以下，生物量在40%以上，莫能菌素效价不低于40000U/mL时，发酵结束；
[0013]发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:葡萄糖2.0?3.8%，黄豆饼粉
1.8?3.7%，植物油1.9?2.5%，油酸甲酯0.05?1.0%，碳酸钙0.15?0.35%，硫酸钠0.15?0.22 %，硝酸钠0.15?0.22 %，氯化锰0.0I?0.03 %,硫酸亚铁0.005?0.0I %,抗坏血酸0.001?0.002%，硫酸铝0.05?0.07%，磷酸氢二钾0.005?0.01%，消泡剂0.01?0.02%，余量为水；
[0014]c.提取
[0015]发酵结束后，先将发酵液pH值调至10?11，然后再加热至63 °C并保温3小时，分别加入无水硅酸钠和碳酸钙后，将发酵液PH值调至7?8并放置30分钟，最后喷雾干燥；所述无水娃酸钠加入量为发酵液重量的6%,所述碳酸?丐加入量为发酵液重量的O?35%;所述喷雾干燥的条件为:进风温度140?160°C ;干燥室内温度65?95°C，排风温度60?70 °C，干燥器内压力-280?-380MPa。
[0016]优选的，所述步骤a中所述种子摇瓶培养所需的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉1.5%，酵母粉0.2 %，葡萄糖0.4 %，糊精1.0%，碳酸钙0.06 %，余量为水。
[0017]优选的，所述步骤a中所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖2%，碳酸钙0.25%，消泡剂0.1 %，余量为水。
[0018]优选的，所述步骤a中所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:葡萄糖3 %，黄豆饼粉3%，植物油2%，油酸甲酯1.0%，碳酸钙0.2%，硫酸钠0.2%，硝酸钠0.2%,氯化锰0.02 %，硫酸亚铁0.01 %，抗坏血酸0.001 %，硫酸铝0.06 %，磷酸氢二钾0.01%,消泡剂0.01%,余量为水。
[0019]优选的，所述步骤a为将经过菌种制备得到的菌种依次进行种子摇瓶培养和种子罐培养；所述种子摇瓶培养的培养条件为以220?260rpm的转速，在32±0.5°C条件下培养25h ;所述种子罐培养的接种量为0.0035%种子液；所述种子罐培养的培养条件为在温度为32 ± 0.5°C，罐压为0.04MPa条件下培养24h。
[0020]优选的，所述步骤b为将步骤a培养过后的含菌种的培养液转入发酵罐内进行发酵培养，发酵培养条件为:罐内温度为34土 1°C，溶氧量在30%以上，罐压在0.03MPa，发酵过程中通过添加氨水溶液、植物油和无菌水，以使发酵液PH值维持在6.5?6.6之间，植物油按质量百分浓度计不低于3%，溶氧量不低于30%，发酵过程结束前24?48小时停止加植物油；当发酵液PH为6.9，残油量为0.6%，生物量在45%，莫能菌素效价为45690u/mL时，发酵结束。
[0021]优选的，所述步骤c为先将发酵液pH值调至10.8，然后加热到63°C并保温3小时，加入无水硅酸钠和碳酸钙后将发酵液PH值调至7并放置30分钟，最后喷雾干燥；所述无水娃酸钠加入量为发酵液重量的6%,所述碳酸?丐加入量为发酵液重量的20%;所述喷雾干燥的条件为:进风温度155°C ;干燥室内温度87°C，排风温度67°C，干燥器内压力_300MPa。
[0022]在种子摇瓶培养过程中，当培养液pH值为6.6?6.7，生物量为6.9?15%，颜色为灰白色，且镜检结果显示菌丝生长良好，带有许多分枝成纤维状、无杂菌时，转为种子罐培养。
[0023]在种子罐培养过程中，当培养至种子龄为20?24h，培养液pH值为6.6?7.1，生物量为10%以上，镜检结果显示菌丝粗壮呈网状、舒展、染色深、无杂菌时，转为发酵培养。
[0024]本发明的有益效果在于:本发明发酵工艺简单，能有效提高发酵单位，降低生产成本，同时避免了动物源性氮源以及化学有机溶剂的使用，防止有机溶剂对莫能菌素预混剂造成污染，避免了对动物的危害；并且采用本发明所述培养基利于莫能菌素特殊结构的合成，从而提高莫能菌素收率，还能有利于后续对莫能菌素预混剂的提取；另外，采用一步喷雾干燥，不会产生污水，降低了环境污染；所制得的莫能菌素成品含量为20%以上，颗粒率达75%以上，显著提高了产品颗粒率，实现莫能菌素稳定高效生产。
【具体实施方式】
[0025]下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0026]实施例1
[0027]莫能菌素预混剂的制备方法如下:
[0028]a.种子培养
[0029]I)菌种制备
[0030]取含肉地桂链霉菌的砂土管,无菌条件下加入5mL无菌水摇勻，然后用无菌接种针将其涂于产孢子斜面培养基中，并置于32°C ±0.5°C培养11天。
[0031]2)种子摇瓶培养
[0032]将步骤I)制备的孢子接种到摇瓶培养的培养基中，以220_260rpm的转速，在32±0.5°C下恒温培养25小时。
[0033]摇瓶培养的培养基按质量百分浓度计由下列组分组成:黄豆饼粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖0.4%，糊精1.0%，碳酸钙0.06%，余量为水；灭菌后培养基pH值为7.05。
[0034]3)种子罐培养
[0035]将步骤2)培养过后的菌种加入种子罐中，接种量为0.0035%种子液，在温度为32 ± 0.5°C，罐压为0.04MPa条件下培养24h，取样检测。
[0036]检测结果:外观呈浅黄色，稠，气味正常，无杂菌，pH值为6.7，生物量为18%，莫能菌素效价为160U/mL，菌丝粗壮呈网状、舒展、染色深，达到种子培养液质控指标。
[0037]所用培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖2%，碳酸钙0.25%，消泡剂0.1%，余量为水；灭菌后pH值为6.7。
[0038]b.发酵培养
[0039]将种子培养的培养液移种至发酵罐内，罐内温度维持在34土1°C，溶氧量在30%以上，罐压在0.03MPa。发酵过程中通过添加氨水溶液、植物油和无菌水，以使发酵液pH值维持在6.5?6.6之间，植物油按质量百分浓度计不低于3%，溶氧量不低于30%，发酵过程结束前24?48小时停止加植物油；发酵至290小时结束，取样检测。
[0040]检测结果:pH值为6.9，生物量为45 %，莫能菌素效价为45690U/mL，残油为0.6%,此时菌丝开始断节,部分自溶。
[0041 ] 所述发酵培养的培养基按质量百分浓度计为:葡萄糖3 %，黄豆饼粉3 %，植物油2%，油酸甲酷1.0*%，碳酸令丐0.2%,硫酸纳0.2*%，硝酸纳0.2*%，氣化猛0.02%,硫酸亚铁0.01%,抗坏血酸0.001 %，硫酸铝0.06%，磷酸氢二钾0.01 %，消泡剂0.01 %，余量为水。培养基用NaOH调pH值至8.2，定容灭菌后备用。
[0042]c.提取
[0043]发酵结束后，先用NaOH将发酵液pH值调至10.8，然后加热到63°C保温3小时，再加入无水硅酸钠，无水硅酸钠加入量为发酵液重量的6%，然后加入碳酸钙，加入量为发酵液重量的20%，之后用硫酸或盐酸将发酵液pH值调至7并放置半小时，最后喷雾干燥。喷雾干燥条件为:进风温度155°C ;干燥室内温度87°C，排风温度67°C，干燥器内压力为-300MPa。最后莫能菌素成品含量为34%，颗粒率87%。
[0044]实施例2
[0045]莫能菌素预混剂的制备方法如下:
[0046]a.种子培养
[0047]I)菌种制备同实施例1。
[0048]2)种子摇瓶培养
[0049]操作同实施例1。
[0050]摇瓶培养的培养基按质量百分浓度计由下列成分组成:黄豆饼粉1.4%，酵母粉0.2%，葡萄糖0.35%，糊精1.5%，碳酸钙0.08 %，余量为水。培养基灭菌后pH值为7.0。
[0051]3)种子罐培养
[0052]将步骤2)培养过后的菌种加入种子罐中，接种量为0.0035%种子液，在温度为32 ± 0.5°C，罐压为0.04MPa条件下培养23h，取样检测。
[0053]检测结果:外观呈浅黄色，稠，气味正常，无杂菌，pH值为6.9，生物量为20%，莫能菌素效价为178U/mL，菌丝粗壮呈网状、舒展、染色深，达到种子培养液质控指标。
[0054]所用培养基按质量百分浓度计由下列成分组成:黄豆饼粉1.0%，酵母粉0.15%,葡萄糖2.1%，碳酸钙0.2%，消泡剂0.1%，余量为水。灭菌后培养基pH值为6.7。
[0055]b.发酵培养
[0056]将步骤3)培养的菌种移种至发酵罐内，罐内温度维持在34±1°C，溶氧量在30%以上。发酵过程中通过添加氨水溶液、植物油和无菌水，以使发酵液PH值维持在6.5?6.6之间，植物油按质量百分浓度计不低于3%，溶氧量不低于30%，发酵过程结束前24?48小时停止加植物油；发酵至275小时结束，取样检测。
[0057]检测结果:pH值为6.8，生物量为50%，莫能菌素效价为51430u/mL，残油为
0.7%，此时菌丝开始断节，部分自溶。
[0058]所述发酵培养的培养基按质量百分浓度计为:葡萄糖3%，黄豆饼粉2.2%，植物油2.2 *%，油酸甲酷1.0 %,碳@^丐0.2%,硫酸纳0.2 *%，硝酸纳0.2 *%，氣化猛0.01 %,硫酸亚铁0.01 %，抗坏血酸0.001 %，硫酸铝0.05%，磷酸氢二钾0.01 %，消泡剂0.01 %，余量为水。培养基用NaOH调pH值至8，定容灭菌后备用。
[0059]c.提取
[0060]先将发酵液pH值调至10.5，然后加热到63°C保温3小时，再加入无水硅酸钠，力口入量为发酵液重量的6%,之后加入碳酸I丐,其加入量为发酵液重量的15%。再将发酵液的pH值调至7.2并放置半小时,最后喷雾干燥。喷雾干燥条件为:进风温度160°C ;干燥室内温度90°C，排风温度72°C，干燥器内压力为-310 MPa。最后莫能菌素成品含量为30%，颗粒率80%。
[0061]需要说明的是，提取过程中碳酸钙的加入量与放罐效价有关，放罐时莫能菌素效价高，则碳酸钙加入量增大。
[0062]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.莫能菌素预混剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: a.种子培养 将经过菌种制备得到的肉桂地链霉菌依次进行种子摇瓶培养和种子罐培养；所述种子摇瓶培养的培养条件为以220?260rpm的转速，在32±0.5°C条件下培养24?27h ；所述种子罐培养的接种量为0.0035%种子液；所述种子罐培养的培养条件为在温度为32 ± 0.5°C，罐压为0.02?0.05MPa条件下培养20?24h ； 所述种子摇瓶培养所需的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉I?1.5%，酵母粉0.1?0.3%，葡萄糖0.2?0.5%，糊精1.0?2.0%，碳酸钙0.05?0.1%，余量为水；培养基灭菌后pH值为6.9?7.1 ; 所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉1.0?1.5%，酵母粉0.1?0.25 %，葡萄糖L 5?2.5 %，碳酸钙0.1?0.25 %，消泡剂0.05?0.1 %，余量为水；培养基灭菌后pH值为6.6?7.1 ; b.发酵培养 将步骤a培养过后的含菌种的培养液转入发酵罐内进行发酵培养，发酵培养条件为:罐内温度34土 1°C，溶氧量30%以上，罐压0.03?0.05MPa ;发酵过程中通过添加氨水溶液、植物油和无菌水，以使发酵液PH值维持在6.5?6.6之间，植物油按质量百分浓度计不低于3 %，溶氧量不低于30%，发酵过程结束前24?48小时停止加植物油；当发酵液pH值达6.6?7.0，残油量为0.7%以下，生物量在40%以上，莫能菌素效价不低于40000U/mL时，发酵结束； 发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:葡萄糖2.0?3.8%，黄豆饼粉1.8?3.7%，植物油1.9?2.5%，油酸甲酯0.05?1.0%，碳酸钙0.15?0.35%，硫酸钠0.15?0.22%,硝酸钠0.15?0.22 %，氯化锰0.0I?0.03 %，硫酸亚铁0.005?0.0I %，抗坏血酸0.001?0.002%，硫酸铝0.05?0.07%，磷酸氢二钾0.005?0.01%，消泡剂0.01?0.02%，余量为水； c.提取 发酵结束后，先将发酵液pH值调至10?11，然后再加热至63°C并保温3小时，分别加入无水硅酸钠和碳酸钙后，将发酵液PH值调至7?8并放置30分钟，最后喷雾干燥；所述无水娃酸钠加入量为发酵液重量的6%,所述碳酸I丐加入量为发酵液重量的O?35%;所述喷雾干燥的条件为:进风温度140?160°C;干燥室内温度65?95°C，排风温度60?70°C，干燥器内压力-280?-380MPa。
2.根据权利要求1所述莫能菌素预混剂的制备方法，其特征在于，所述步骤a中所述种子摇瓶培养所需的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖0.4%，糊精1.0%，碳酸钙0.06 %，余量为水。
3.根据权利要求1所述莫能菌素预混剂的制备方法，其特征在于，所述步骤a中所述种子罐培养的培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:黄豆饼粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖2 %，碳酸钙0.25%，消泡剂0.1%，余量为水。
4.根据权利要求1所述莫能菌素预混剂的制备方法，其特征在于，所述步骤a中所述发酵培养基按质量百分浓度计由以下成分组成:葡萄糖3%，黄豆饼粉3 %，植物油2%，油酸甲酷1.0*%，碳Ifef丐0.2%,硫酸纳0.2*%，硝酸纳0.2*%，氣化猛0.02 %，硫酸亚铁0.01 %,抗坏血酸0.0Ol %，硫酸铝0.06%，磷酸氢二钾0.01 %，消泡剂0.01 %，余量为水。
5.根据权利要求1所述莫能菌素预混剂的制备方法，其特征在于，所述步骤a为将经过菌种制备得到的菌种依次进行种子摇瓶培养和种子罐培养；所述种子摇瓶培养的培养条件为以220?260rpm的转速，在32±0.5°C条件下培养25h ;所述种子罐培养的接种量为0.0035%种子液；所述种子罐培养的培养条件为在温度为32±0.5°C，罐压为0.04MPa条件下培养24h。
6.根据权利要求1所述莫能菌素预混剂的制备方法，其特征在于，所述步骤b为将步骤a培养过后的含菌种的培养液转入发酵罐内进行发酵培养，发酵培养条件为:罐内温度为34±1°C，溶氧量在30%以上，罐压在0.03MPa，发酵过程中通过添加氨水溶液、植物油和无菌水，以使发酵液PH值维持在6.5?6.6之间，植物油按质量百分浓度计不低于3%，溶氧量不低于30 %，发酵过程结束前24?48小时停止加植物油；当发酵液pH为6.9，残油量为0.6 %，生物量在45 %，莫能菌素效价为45690u/mL时，发酵结束。
7.根据权利要求1?6任一项所述莫能菌素预混剂的制备方法，其特征在于，所述步骤c为先将发酵液pH值调至10.8，然后加热到63°C并保温3小时，加入无水硅酸钠和碳酸钙后将发酵液PH值调至7并放置30分钟，最后喷雾干燥；所述无水硅酸钠加入量为发酵液重量的6%，所述碳酸钙加入量为发酵液重量的20% ;所述喷雾干燥的条件为:进风温度1550C ;干燥室内温度87°C，排风温度67°C，干燥器内压力_300MPa。
【文档编号】C12R1/465GK104313079SQ201410608474
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】谢昌贤, 邓维康, 刘运添, 王鹏飞 申请人:金河生物科技股份有限公司