一种提高猪细胞重编程能力的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高猪细胞重编程能力的方法及应用，属于细胞移植和胚胎发育【技术领域】。本发明所提供的方法是在获取并培养猪卵母细胞和猪胎儿成纤维细胞后，进行体细胞核移植，最后进行iPS诱导并进行碱性磷酸酶染色。方法中利用小分子药物GSK126进行了处理，其使用方式有以下三种：1)猪胎儿成纤维细胞在核移植前利用小分子药物GSK126进行处理；2)在猪胎儿成纤维细胞体细胞核移植后，利用小分子药物GSK126处理融合胚胎；3)用于iPS诱导的猪胎儿成纤维细胞，在培养成熟后接种前利用小分子药物GSK126进行处理。本发明所提供的方法可以显著提高克隆胚胎的发育率和iPS诱导效率，提高幅度分别达到44.7％和111.3％。
【专利说明】一种提高猪细胞重编程能力的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高猪细胞重编程能力的方法及应用，属于细胞移植和胚胎发育
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 体细胞核移植技术是一种细胞重编程技术，自从克隆羊"Dolly"诞生以来，该技术 先后在多种哺乳动物上取得成功，但克隆效率普遍很低，平均在〇. 1% -2. 0%之间。为提高 核移植效率，研究人员在核移植技术程序、卵母细胞成熟质量、体外胚胎培养条件、供核细 胞的筛选和预处理等方面进行了大量的研究，虽然取得了一定进展，但克隆效率仍然有待 提高。目前认为克隆效率低下的最主要原因是体细胞核重编程不完全。体细胞核重编程是 指供体细胞核移入卵母细胞后停止本身的基因表达程序，恢复为胚胎发育所必需的特定基 因表达程序。这个过程主要是卵母细胞对供体细胞表观遗传修饰进行重新编写，其中包括 染色体重塑、DNA甲基化重建、组蛋白修饰改变和印记基因表达调控等。如果体细胞核移植 过程中，供体细胞的组织特异的表观遗传修饰不能被有效地消除，将会影响胚胎的正常发 育。因此促进体细胞核表观遗传重编程将有助于提高核移植效率。
[0003]目前，已经发现了一些药物处理供体细胞或克隆胚胎能够在一定程度上提高克隆 效率，如甲基化或去乙酰化抑制剂（5-氮胞苷（542六-(1〇，曲古抑菌素4〇^六)）。542六-况 和TSA通过促进甲基化和乙酰化水平的重编程来提高克隆效率。但这些药物都没有彻底解 决克隆效率低下的问题。
[0004] 采用甲基化或去乙酰化抑制剂处理供体细胞或克隆胚胎，通过调节甲基化和乙酰 化水平不能有效的提高克隆效率的原因是：导致克隆胚胎发育率低下的核移植重编程异常 是多方面的，不止包括甲基化和乙酰化水平异常，虽然甲基化或去乙酰化抑制剂的预处理 能够改善核移植重编程的某些方面，但要想让克隆效率达到一个更高水平，人们必须从更 多角度进行探索促进核移植重编程的方法。
[0005]H3K27me3是一种重要的组蛋白修饰，对基因表达有抑制作用。在猪体外受精胚胎 (IVF)中，H3K27me3在Ι-cell位于雌原核中，在2-cell以后水平急剧下降，4-cell以后一 般检测不到其存在，直到晚期囊胚才在滋养层细胞中又开始出现。人们一般认为H3K27me3 在早期胚胎的迅速擦除有利于早期胚胎（特别是合子基因激活）时期的基因表达。但在猪 克隆胚胎中，H3K27me3的分布情况，即H3K27me3是否被有效的重编程还没有被报道。
[0006] 诱导多能性干细胞（iPS)技术是体细胞核移植技术以外另一种细胞重编程技术。 它通过人为向细胞中导入几个外源基因使细胞命运发生改变。但是目前iPS技术诱导效率 普遍偏低。虽然iPS技术和核移植技术的技术路径和原理有着很大的不同，但是这两种方 法的重编程过程却有着很大的相似性，都需要克服源头细胞的分化状态的表观修饰来达到 多能性状态。所以提高克隆效率的方法也有可能能够提高iPS诱导效率。
[0007]GSK126是一种高效和特异性的EZH2的小分子抑制剂，能够降低H3K27me3的整体 水平，GSKl26可以作为治疗EZH2突变的淋巴瘤的药物。但是，在重编程领域一直没有应用， 目前尚未发现GSK126可用于提高胚胎发育或iPS诱导效率的作用。
【发明内容】
[0008] 为解决上述问题，本发明提供了一种提高猪细胞重编程能力的方法，采取的技术 方案如下：
[0009] -种提高猪细胞重编程能力的方法，是在获取并培养猪卵母细胞和猪胎儿成纤维 细胞后，进行体细胞核移植，最后进行iPS诱导并进行碱性磷酸酶染色，其特征在于，以下 列任意一种方式使用小分子药物GSK126 :
[0010]1)猪胎儿成纤维细胞在核移植前利用小分子药物GSK126进行处理；
[0011] 2)在猪胎儿成纤维细胞体细胞核移植后，利用小分子药物GSK126处理融合胚胎；
[0012] 3)用于iPS诱导的猪胎儿成纤维细胞，在培养成熟后接种前利用小分子药物 GSK126进行处理。
[0013] 1)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0. 5-3. 0μM的GSK126处理 40-50h。
[0014] 优选地，1)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0· 5μM的GSK126处 理 48h。
[0015] 2)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0. 05-0. 15以11的651(126处理 18-30h。
[0016] 优选地，2)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0· 1μM的GSK126处 理 24h。
[0017] 所述方法用于提高克隆胚胎的发育率。
[0018] 3)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0. 5-3. 0μM的GSK126处理 40-50h。
[0019] 优选地，3)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0. 75yi^^GSK126& 理 48h。
[0020] 所述方法用于提高诱导多能干细胞的诱导效率。
[0021] 本发明有益效果：为解决现有技术中细胞核移植效率低的问题，克服现有技术通 过甲基转移酶或去乙酰化酶抑制剂处理体细胞或核移植胚胎不能全面促进核移植重编程 的局限性，本发明通过对猪卵裂期的受精胚胎和克隆胚胎的H3K27me3的分布模式进行比 较，发现猪克隆胚胎中的H3K27me3不能被正常重编程，早期克隆胚胎的H3K27me3水平高 于IVF胚胎。小分子药物GSK126是一种高效和特异性的EZH2的小分子抑制剂，能够降低 H3K27me3的整体水平，GSK126常作为治疗EZH2突变的淋巴瘤的药物。发明人在研究过程 中意外发现，小分子药物GSK126对提高克隆胚胎的发育率和iPS的诱导效率具有积极作 用。据此，本发明通过用小分子药物GSK126处理供体细胞或克隆胚胎，促进H3K27me3的 重编程，最终使得猪克隆胚胎的发育率提高了 44.7%。本发明在诱导猪多能性干细胞时用 GSK126进行处理，使得猪多能性干细胞诱导效率，提高幅度达到111. 3%。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为猪胎儿成纤维细胞（PEF)经不同浓度GSK126处理48后细胞数及H3K27me3 水平变化；
[0023] (a，GSK126浓度对PEF细胞数的影响；b，GSK126浓度对H3K27me3水平影响）。
[0024] 图2为经GSK126处理的PEF核移植后l-cell、2-cell克隆胚胎的H3K27me3水平。
[0025] 图3为克隆胚胎经GSK126处理24h后的H3K27me3水平。
[0026] 图4为经GSK126处理的PEF诱导iPS时的碱性磷酸酶（AP)阳性克隆数。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0028] 以下实施例中所用试剂、材料、仪器和方法，未经特别说明，均为本领域中常用的 试剂、材料、仪器和方法。
[0029] 实施例1
[0030] 1.猪卵母细胞的成熟培养
[0031] 由屠宰场收集卵巢并用37°C的生理盐水运送回实验室，抽取3_5mm直径的有腔卵 泡收集卵丘卵母细胞复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞的卵母细胞 用于成熟培养；成熟培养的培养条件为38. 5 °C，5 %二氧化碳、95 %空气的气体环境，饱和 湿度；成熟培养42小时后采用0. 5%透明质酸酶去除卵丘细胞，获的MII期卵母细胞，作为 核移植受体。
[0032] 2.猪胎儿成纤维细胞的获得和培养
[0033] 无菌操作取35天猪胎儿组织，采用常规0. 25%胰蛋白酶（Gibco)消化法分离组织 细胞，DMEM(Gibco)添加20%胎牛血清原代培养，DMEM添加10%胎牛血清传代培养，培养条 件为38. 5°C，5%二氧化碳、95%空气的气体环境，饱和适度；采用3-5代的接触抑制的胎儿 成纤维细胞消化为单个悬浮细胞进行核移植。
[0034] 3.体细胞核移植
[0035] 猪体细胞核移植采用融合法进行，过程如下：盲吸法去除MII卵的纺锤体及第一 极体，体细胞注于透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧密接触，直流电击（I. 2kv/cm、30μs、 2次脉冲）诱导体细胞与去核卵胞质融合形成重构胚并使之被激活，培养于ΡΖΜ-3培养液 中，培养条件为：38. 5 °C，5 %C02，饱和湿度。培养至48h计算卵裂率，146h计算囊胚率。5mg/ LHoechst33342对囊胚进行染色5min，荧光镜下观察记囊胚细胞数；所用工具、液体、仪 器如下：固定管内径为30μm，注射管内径25μm;卵母细胞操作液为含5mg/mlBSA的改进 型TCM199 (Gibco)，卵母细胞显微操作液为添加7. 5μg/ml细胞松弛素B(CB)的操作液，融 合液为含I.OmM钙离子和0.ImM镁离子的3%甘露醇溶液；显微操作系统为日本Narishige 公司NT-88NE系统；融合仪为美国BTX公司BTX2001型电细胞融合仪。
[0036] 4.iPS诱导及碱性磷酸酶染色
[0037] 采用鼠源6因子方法诱导1卩5(听1叩，了.，611，〇.，他〇，丄，了1&，￥.，父脱，8.，"11，!1· ,Ma, J. , Wei, R. , Hai, T. , Kong, Q. , Bou, G. , Xia, P. , Zhou, Q. , Wang, L. , and Liu, Z. (2013). Tbx3and Nr5alpha2play important roles in pig pluripotent stem cells. Stem Cell Rev.9,700 - 708.)。按照之前方法制备逆转录病毒和饲养层细胞。P3或P4代的PEF用于 诱导iPSCs。Day-I :接种I X IO5PEF到每个6孔板的孔中；DayO :按MOI为5的病毒量把6 个因子的病毒同时加到事先接种好的PEF里，同时加8ug/mL polybrene ;Dayl :换液，从今 天开始可以加青霉素链霉素的培养液；Day3:换液，观察细胞，并准备饲养层；Day4:感染细 胞长至90%以上的汇合度时，将PEF传到饲养层上，用10%FBS的DMEM培养液培养；Day5: 弃去10 %FBS的DMEM培养液，用X培养液培养，以后每天换液；X培养液配方为（50mL): 19mLK0-DMEM、12.25mLDMEM/F12、12.25mLNeurabasal、5mLK0SR、250uLB27、125uLN2、 250uL谷氨酰胺（2mM)、25uLβ-巯基乙醇、500uL双抗、250uL非必需氨基酸、4uLbFGF、5uL hLif、31.25uL2%BSA。Day9:做碱性磷酸酶染色。先用PBS洗三遍，再用4%多聚甲醛室 温固定90s，PBS洗三次，每次5分钟（或放置室温15分钟），用lOOmmol/LTris-HCl(pH 9. 5)，lOOmmol/LNaCl，50mmol/LMgC12混合缓冲液洗5分钟，在ImlPBS中加入四氮唑蓝 (NBT) 4. 5μ1和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP) 3. 5μ1，避光显色20分钟?1小时，随 时观察染色情况。用PBS洗涤3遍，直接在倒置显微镜下即可观察，照相。
[0038] 实施例2
[0039] 1.猪卵母细胞的成熟培养（同实施例1)
[0040] 2.猪胎儿成纤维细胞的获得和培养
[0041]PEF在核移植前分别用0. 5μΜ、0. 75μM和3μMGSK126处理48h。其余同实施例 1〇
[0042] 3.体细胞核移植（同实施例1)
[0043] 实施例3
[0044] 1.猪卵母细胞的成熟培养（同实施例1)
[0045] 2.猪胎儿成纤维细胞的获得和培养（同实施例1)
[0046] 3.体细胞核移植
[0047] 融合后的胚胎用0. 05μM、0. 1μM和0. 15μMGSK126处理24h。之后将胚胎置于 正常PZM-3中继续培养。其余同实施例1。
[0048] 实施例4
[0049] 1.猪胎儿成纤维细胞的获得和培养（同实施例1)
[0050] 2.iPS诱导及碱性磷酸酶染色
[0051] 用于iPS诱导的PEF在往6孔板接种前用0. 5μM、0. 75μM和3μMGSK126处理 48h。其余同实施例1。
[0052] 实施例5
[0053] 1.不同浓度GSK126对细胞数和H3K27me3水平变化的影响
[0054] 为了降低供体细胞的H3K27me3水平，我们用不同浓度的GSK126处理PEF48h。图 1为PEF经不同浓度GSK126处理48后细胞数（A)及H3K27me3水平⑶变化。从图1中可 以发现0-3μM时各组的细胞状态良好，并且各组的细胞数也没有差异（A)。对各组细胞的 H3K27me3水平进行检测，发现GSK126能够降低PEF的H3K27me3水平，特别是浓度XX5μM 时效果较为显著（Ρ〈〇. 05) (B)。
[0055] 2. GSK126处理PEF对克隆胚胎发育的影响
[0056] 表1经GSK126处理的PEF的克隆胚胎发育率
[0057]
【权利要求】
1. 一种提高猪细胞重编程能力的方法，是在获取并培养猪卵母细胞和猪胎儿成纤维细 胞后，进行体细胞核移植，最后进行iPS诱导并进行碱性磷酸酶染色，其特征在于，以下列 任意一种方式使用小分子药物GSK126 : 1) 猪胎儿成纤维细胞在核移植前利用小分子药物GSK126进行处理； 2) 在猪胎儿成纤维细胞体细胞核移植后，利用小分子药物GSK126处理融合胚胎； 3) 用于iPS诱导的猪胎儿成纤维细胞，在培养成熟后接种前利用小分子药物GSK126进 行处理。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于，1)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是 利用 0? 5-3. 0 ii M 的 GSK126 处理 40-50h。
3. 权利要求2所述方法，其特征在于，所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用 0? 5iiM 的 GSK126 处理 48h。
4. 权利要求1所述方法，其特征在于，2)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是 利用 〇? 05-0. 15 ii M 的 GSK126 处理 18-30h。
5. 权利要求4所述方法，其特征在于，所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用 0. liiM 的 GSK126 处理 24h。
6. 权利要求1-5所述方法，其特征在于，用于提高克隆胚胎的发育率。
7. 权利要求1所述方法，其特征在于，3)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是 利用 0? 5-3. 0 ii M 的 GSK126 处理 40-50h。
8. 权利要求7所述方法，其特征在于，所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用 0. 75 ii M 的 GSK126 处理 48h。
9. 权利要求1，7和8所述方法，其特征在于，用于提高诱导多能性干细胞的诱导效率。
【文档编号】C12N15/877GK104357483SQ201410613163
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】孔庆然, 解炳腾, 刘忠华 申请人:东北农业大学