一种鹿脾提取物提取方法及在提高免疫力药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种鹿脾提取物提取方法及在提高免疫力药物中的应用，采用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶及5’-磷酸二酯酶制成的复合酶对鹿脾进行酶解，具有协同作用，相比于单个酶提取多肽提取率提高了90%，核酸提取率提高了75%。具有工业化生产价值。
【专利说明】一种鹿脾提取物提取方法及在提高免疫力药物中的应用
[0001]
【技术领域】： 本发明公开一种鹿脾提取物提取方法，本发明还进一步提供了鹿脾提取物在提高免疫 力药物中的应用，属于生物制药【技术领域】。
[0002] 技术背景： 鹿脾是鹿科动物梅花鹿或马鹿的脾。中国历代医学家认为，鹿尾仙兽，纯阳多寿之物， 全身皆益于人。鹿制品均具有极高的药用价值和保健功效。从脾中提取多肽或核酸等小分 子，又名转移因子，具有减轻或消除癌症人化疗、放疗引起的毒副作用等功能，主要应用于 生物医药领域。
[0003] 转移因子是由T淋巴细胞所释放的一类可透析的小分子多肽和核苷酸复合物，具 有增强淋巴细胞转化，从而提高机体免疫功能的作用。目前，转移因子的提取方法多为匀 浆、冻融、透析等物理方法提取转移因子，但物理方法的提取率非常低。
[0004]随着生物技术的发展，转移因子的提取方法逐渐改进，有专利《一种鹿脾提取物制 剂及其制备方法》专利号ZL201210171730. 9,对鹿脾提取通过加入胃蛋白酶、胰蛋白酶或中 性蛋白酶进行酶解，提取物中核酸的提取率仍然极低，由于其选用的蛋白酶仅能酶解鹿脾 中部分蛋白，酶解的能力有限，提取的有效多肽提取率也较低。
[0005] 5'-磷酸二酯酶是一种能将单链DNA和RNA水解为5'-核苷酸的磷酸二酯酶，一 般用于分析主基因组、双链环形DNA质粒或类质粒结构等分子生物学领域，或者用于5'-核 苷酸生产；本发明首次将其应用在生物鹿脾的提取工艺，其与木瓜蛋白酶和中性蛋白酶具 有协同作用，可以同时提高多肽和核糖的提取率。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了鹿脾提取物在提高免疫力药物中的用途，可用于制备提高免疫力作 用的药物和保健食品，在剂型方面可采用各种剂型，如口服液、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶 囊等剂型或缓释制剂。
[0007] 本发明进一步公开了一种鹿脾提取物的制备方法，为一种新的制备方法，提高了 多肽和核糖的提取率。
[0008] 本发明公开的一种鹿脾提取物的制备方法，包括以下步骤： 1) 称取鹿脾200份，去除表面结缔组织； 2) 加入2:1~5:1倍重量的去离子水或生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨2~10min ; 3) 将鹿脾混悬液升温至65~70°C，调pH值至5飞，加入2~7%重量的复合酶酶解，保温 2?3h ; 4) 将混悬液用4000g离心力下离心IOmin取上清，用IOKD超滤膜进行超滤得超滤液， 喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。
[0009] 所述的复合酶为木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶：5' -磷酸二酯酶的质量比为1~2. 5 : 1?2:2?5; 所述的木瓜蛋白酶活力为800U/g，菠萝蛋白酶活力为50000U/g，5'-磷酸二酯酶酶活 力为 8〇ou/g。
[0010]所述的鹿脾提取物中含15~30重量份多肽、I. 0~2. 7重量份核酸。
[0011] 本发明的积极效果在于：采用木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶：5'_磷酸二酯酶制成的复 合酶对鹿脾进行酶解，具有协同作用，相比于单个酶提取多肽提取率提高了 90%，核酸提取 率提高了 75%;相比于专利ZL201210171730. 9提取方法，多肽和核酸提取率有显著提高。同 时采用本发明方法得到的鹿脾提取物的增强免疫力作用显著高于专利ZL201210171730. 9 的鹿脾提取物。
[0012]
【具体实施方式】： 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而不用 于限定本发明的范围，对照例1和2再现专利ZL201210171730. 9提取工艺。
[0013] 实施例1 : s .称取鹿脾200g，去除表面结缔组织； t .加入400ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨5min ; c .将鹿脾混悬液升温至70°C，调pH值至6.0,加入4. 8g木瓜蛋白酶，2. 4g菠萝蛋白 酶和5. Og 5' -磷酸二酯酶酶解保温2h ; E.将混悬液用4000g离心力下离心IOmin取上清，用IOKD超滤膜进行超滤得超滤液， 喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12. 67%，核 酸提取率为1. 79%。
[0014] 实施例2: s .称取鹿脾200g，去除表面结缔组织； t .加入600ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨2min; C.将鹿脾混悬液升温至65°C，调pH值至5. 5,加入2. 5g木瓜蛋白酶，2. 5g菠萝蛋白 酶和5. Og 5' -磷酸二酯酶酶解保温2h ; E .将混悬液用4000g离心力下离心IOmin取上清，用IOKD超滤膜进行超滤得超滤液， 喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12. 32%，核 酸提取率为1. 57%。
[0015] 实施例3: g .称取鹿脾200g，去除表面结缔组织； t .加入650ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨3min; C.将鹿脾混悬液升温至65°C，调pH值至5,加入2. 7g木瓜蛋白酶，2. Ig菠萝蛋白酶 和5. Ig 5' -磷酸二酯酶酶解保温3h ; E .将混悬液用4000g离心力下离心IOmin取上清，用IOKD超滤膜进行超滤得超滤液， 喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12. 13%，核 酸提取率为1. 68%。
[0016] 实施例4: s .称取鹿脾200g，去除表面结缔组织； t .加入IOOOml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨5min ; C.将鹿脾混悬液升温至69°C，调pH值至5. 5,加入4. 6g木瓜蛋白酶，2. 2g菠萝蛋白 酶和5. 3g 5' -磷酸二酯酶酶解保温3h ; E .将混悬液用4000g离心力下离心IOmin取上清，用IOKD超滤膜进行超滤得超滤液， 喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12. 24%，核 酸提取率为1. 87%。
[0017] 实施例5 : s .称取鹿脾200g，去除表面结缔组织； t .加入600ml生理盐水，胶体磨等高速剪切机研磨5min; c .将鹿脾混悬液升温至70°C，调pH值至6,加入4. Ig木瓜蛋白酶，3. 9g菠萝蛋白酶 和4. 6g 5' -磷酸二酯酶酶解保温2h ; E .将混悬液用4000g离心力下离心IOmin取上清，用IOKD超滤膜进行超滤得超滤液， 喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末。本次提取多肽提取率为12. 26%，核 酸提取率为1. 47%。
[0018] 对照例1，再现专利号：ZL201210171730. 9提取工艺： 取200 g鹿脾，去离子洗净，去血，将筋膜去掉，剪碎后加入5倍的去离子水，放入胶体 磨中搅碎，3000 rpm，时间为10 min。将搅碎后混悬液PH至2. 4,然后加入500 U/g的胃 蛋白酶，在37°C下水解4 h。然后将水解后混悬液离心，3000 rpm离心10 min，收集上清， 旋转蒸发浓缩，喷雾干燥既得鹿脾提取物干燥粉末。该提取多肽提取率为7. 15%，核酸提取 率为0. 56%。
[0019] 对照例2,再现专利号：ZL201210171730. 9提取工艺： 取200 g鹿脾，去离子洗净，去血，将筋膜去掉，剪碎后加入5倍的生理盐水，放入胶体 磨中搅碎，3000 rpm，时间为10 min。将搅碎后混悬液PH至8. 5,然后加入756 U/g的胰 蛋白酶，在37°C下水解4 h。然后将水解后混悬液离心，5000 rpm离心10 min，收集上清， 旋转蒸发浓缩，喷雾干燥既得鹿脾提取物干燥粉末。该提取多肽提取率为6. 53%，核酸提取 率为0. 49%。
[0020] 以下试验表明本发明工艺采用复合酶的协同作用，提高了核酸、多肽各有效成分 的提取率。
[0021] 表1各种提取方法的提取结果_
【权利要求】
1. 一种鹿脾提取物，是通过以下方法制成的： 1) 称取鹿脾200份，去除表面结缔组织，切成0. 5cm厚的薄片； 2) 加入2:1~5:1倍重量的去离子水或生理盐水，研磨2~10min ; 3) 将鹿脾混悬液升温至65~70°C，调pH值至5飞，加入2~7%重量的复合酶酶解，保温 2?3h ; 4) 将混悬液用4000g离心力下离心IOmin取上清，用IOKD超滤膜进行超滤得超滤液， 喷雾干燥即得具有提高免疫力功能的鹿脾提取物粉末； 所述的复合酶为木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶：5' -磷酸二酯酶的质量比为1~2. 5 :1~2 : 2?5 ; 所述的鹿脾提取物中含15~30重量份多肽、1.0~2.7重量份核酸。
2. 权利要求1所述的鹿脾提取物在制备提高免疫力药物中的用途。
3. 鹿脾提取物可用于制备提高免疫力作用的药物和保健食品，在剂型方面可采用各 种剂型，如口服液、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊等剂型或缓释制剂。
【文档编号】A23L1/29GK104306399SQ201410614548
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】滕利荣, 彭小君, 蔡广胜, 贾东旭, 权宇彤, 孟庆繁, 逯家辉, 王迪, 滕乐生, 王贞佐, 谢晶, 程瑛琨 申请人:吉林大学