一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子标记及其应用，它涉及一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑的分子标记及其应用。本发明要解决现在没有一种准确有效鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑的方法的问题。本发明的用于PCR扩增分子标记的引物对为AF346686F和AF346686R，AF346686F:5’-AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3’，AF346686R:5’-ACT ACG GCT TTC TGG GAT-3’。本发明的分子标记用于鉴别白斑红点鲑(Salvelinus leucomaenis)和美洲红点鲑(Salvelinus fominalis)。
【专利说明】-种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子 标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产动物分子遗传学领域，具体地说，本发明涉及应用微卫星标记对 白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品进行鉴别。
【背景技术】
[0002] 美洲红点鲑（Salvelinus fominalis)和白斑红点鲑（Salvelinus Ieucomaenis) 都隶属于鲑形目（Salmoniformes),鲑科（Salmonidae),红点鲑属（Salvelinus)。美洲红 点鲑，俗称七彩鲑鱼。主要分布于北半球的60° Ν-4Γ N范围内，原产于加拿大东部五大 湖区、明尼苏达州的密西西比河湾、佐治亚州的北部等地。美洲红点鲑生长快、肉质鲜美、营 养丰富，自2000年左右引入我国后迅速成为一种重要淡水养殖鲑科鱼类。白斑红点鲑，俗 称白点鲑，原产于日本，1996年由中国水产科学研究院黑龙江水产研究所引入中国，白斑红 点鲑定居性强，繁殖期死亡率低，目前已经发展成一个冷水性鱼类的主要养殖品种。在我国 的人工养殖条件下，二者的要求较为接近，繁殖水温为KTC左右，繁殖高峰期均在10月下 旬到11月中旬，苗种孵出至开口摄食期间最佳的培育水温为8-KTC，饲养期间水温变化在 4. 7-16. 8°C。
[0003] 两种鱼体型特征和生长速度都较为相似，由于美洲红点鲑体色艳丽，体表斑点有 多种颜色，而白斑红点鲑体表斑点主要呈乳白色，仅凭这项特点即可从外观上对上述两种 鱼进行区分。中国消费者对美洲红点鲑七彩外观有明显的偏好，形成了对美洲红点鲑的选 择性消费偏好；另外从生产者角度考虑，美洲红点鲑繁殖期死亡率显著高于白斑红点鲑，导 致养殖成本高于白斑红点鲑。上述两个因素直接引起美洲红点鲑的市场价格要高于白斑红 点鲑。但是，鲑鱼主要以刺身（生鱼片）和熏肉的形式销售，而这两种方法一般都需要将鱼 皮剥去，而这两种鱼的肉色、口感非常类似，因此，鱼肉制成刺身及熏肉制品后通过感官检 查很难区分其真假。于是，一些不法商贩以白斑红点鲑冒充美洲红点鲑，获取超额利润，损 害了消费者利益。
[0004] 因此，现在急需一种准确有效地鉴别两种鱼的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子标记及应 用，解决目前没有一种准确有效鉴别上述两种鱼的方法的问题。
[0006] 本发明的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子标记，用于 PCR扩增分子标记的引物对为AF346686F和AF346686R，具体序列为：
[0007] AF346686F: 5 ' -AGTCGTCGGCTTGTCTTC-3 '
[0008] AF346686R: 5 ' -ACTACGGCTTTCTGGGAT-3 '。
[0009] 本发明的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子标记的 应用，它用于鉴别白斑红点鲑（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲红点鲑（Salvelinus fominalis)ο
[0010] 本发明包含以下有益效果：
[0011] 采用本发明的分子标记，从基因层面对白斑红点鲑和美洲红点鲑进行区分，从而 避免了通过肉眼感官检查两种鱼的刺身及熏肉制品存在不准确，容易混淆的问题。
[0012] 通过本发明的引物进行PCR检测微卫星标记基因型，若检测得到长度为250bp单 一片段，则待检测样品来源于白斑红点鲑（Salvelinus Ieucomaenis);若检测得到长度为 252bp和999bp两条目的片段，则待检测样品来源于美洲红点鲑（Salvelinus fominalis)。
[0013] 本发明所设计的引物对虹鳟的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物扩增片段长度 介于300?500bp之间，不与白斑红点鲑和美洲红点鲑基因组DNA所获得PCR扩增产物长 度相一致；另外，虹鳟刺身和熏肉制品外观可以凭肉眼感官检查直接区分。因此，虽然该引 物针对虹鳟基因组序列设计获得，但是该引物PCR扩增产物对白斑红点鲑和美洲红点鲑刺 身及熏肉制品进行鉴别区分并不会与虹鳟刺身及熏肉制品相混淆。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为利用引物AF346686F和AF346686R对白斑红点鲑和美洲红点鲑的扩增后的 电泳图；其中，1-10泳道为美洲红点鲑电泳图，11泳道为DL2000marker，12-21泳道为白斑 红点鲑电泳图；
[0015] 图2为利用引物AF346686F和AF346686R对白斑红点鲑、美洲红点鲑和虹鳟的扩 增后的电泳图；其中，1-6泳道为美洲红点鲑电泳图，7-12泳道为白斑红点鲑电泳图，13泳 道为DL2000marker，14-19泳道为虹鳟电泳图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0016] 一：本实施方式的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制 品的分子标记，用于PCR扩增分子标记的引物对为AF346686F和AF346686R，具体序列为：
[0017] AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3'
[0018] AF346686R:5, -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3，。
[0019] 本实施方式中的AF346686F和AF346686R序列如序列表Seq ID No : 1和Seq ID No :2所示。
[0020] 本实施方式的引物是依据虹鳟（Oncorhyncus mykiss)微卫星（Genbank NO.AF346686)序列片段（详见序列表Seq ID No:3所示）设计而成的。
【具体实施方式】 [0021] 二：本实施方式的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制 品的分子标记的应用，它用于鉴别白斑红点鲑（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲红点鲑 (Salvelinus fominalis)〇
[0022]
【具体实施方式】三：本实施方式与【具体实施方式】二不同的是：鉴别白斑红点鲑 (Salvelinus Ieucomaenis)和美洲红点鲑（Salvelinus fominalis)的方法如下：米用 PCR-LP方法，利用权利要求1的引物对，检测待测样品的微卫星标记基因型，若检测得到 长度为250bp单一片段，则待检测样品来源于白斑红点鲑（Salvelinus Ieucomaenis); 若检测得到长度为252bp和999bp两条目的片段，则待检测样品来源于美洲红点鲑 (Salvelinus fominalis),从而完成对白斑红点鲑（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲红点 鲑（Salvelinus fominalis)的鉴别。其它与【具体实施方式】二相同。
【具体实施方式】 [0023] 四：本实施方式与二或三不同的是：所述的采用 PCR-LP方法，利用权利要求1的引物对，检测待测样品的微卫星标记基因型的具体操作如 下：
[0024] 一、提取待测样品的基因组DNA，备用；
[0025] 二、以步骤一提取的基因组DNA为模板，利用AF346686F和AF346686R引物，进行 PCR反应；
[0026] 三、待步骤二的PCR反应结束后，收集PCR产物进行电泳检测，观察电泳条带，若 电泳得到长度为250bp的单一片段，则表明待检测样品来源于白斑红点鲑（Salvelinus leucomaenis);若电泳得到长度为252bp和999bp两条目的片段，则待检测样品来源于美洲 红点鲑（Salvelinus fominalis)，从而完成对白斑红点鲑（Salvelinus Ieucomaenis)和美 洲红点鲑（Salvelinus fominalis)的鉴别；
[0027] 其中，所述的AF346686F和AF346686R引物序列为：
[0028] AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3'
[0029] AF346686R:5'-ACT ACG GCT TTC TGG GAT-3'。其它与【具体实施方式】二或三相同。
[0030] 【具体实施方式】五：本实施方式与【具体实施方式】二至四之一不同的是：所述的PCR 反应体系为：
【权利要求】
1. 一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子标记，其特征在于用于 PCR扩增分子标记的引物对为AF346686F和AF346686R，具体序列为： AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3' AF346686R:5' -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3'。
2. 权利要求1所述的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子标 记的应用，其特征在于它用于鉴别白斑红点鲑（Salvelinus leucomaenis)和美洲红点鲑 (Salvelinus fominalis)〇
3. 根据权利要求2所述的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分 子标记的应用，其特征在于鉴别白斑红点鲑（Salvelinus leucomaenis)和美洲红点鲑 (Salvelinus fominalis)的方法如下：采用PCR-LP方法，利用权利要求1的引物对，检 测待测样品的微卫星标记基因型，若检测得到长度为250bp单一片段，则待检测样品来源 于白斑红点鲑（Salvelinus leucomaenis);若检测得到长度为252bp和999bp两条目的 片段，则待检测样品来源于美洲红点鲑（Salvelinus fominalis)，从而完成对白斑红点鲑 (Salvelinus leucomaenis)和美洲红点鲑（Salvelinus fominalis)的鉴别。
4. 根据权利要求2或3所述的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分 子标记的应用，其特征在于所述的采用PCR-LP方法，利用权利要求1的引物对，检测待测样 品的微卫星标记基因型的具体操作如下： 一、 提取待测样品的基因组DNA，备用； 二、 以步骤一提取的基因组DNA为模板，利用AF346686F和AF346686R引物，进行PCR 反应； 三、 待步骤二的PCR反应结束后，收集PCR产物进行电泳检测，观察电泳条带，若电 泳得到长度为250bp的单一片段，则表明待检测样品来源于白斑红点鲑（Salvelinus leucomaenis);若电泳得到长度为252bp和999bp两条目的片段，则待检测样品来源于美洲 红点鲑（Salvelinus fominalis)，从而完成对白斑红点鲑（Salvelinus leucomaenis)和美 洲红点鲑（Salvelinus fominalis)的鉴别； 其中，所述的AF346686F和AF346686R引物序列为： AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3' AF346686R:5' -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3'。
5. 根据权利要求4所述的一种鉴别白斑红点鲑和美洲红点鲑刺身及熏肉制品的分子 标记的应用，其特征在于所述的PCR反应体系为： 体系 ）im 50 ng/μ丨待检_样品DN Α Ι,ΟμΙ 腫 μη? 丨'.游》j| 物 0·5μ1 ΙΟμηιοΙ/L 卜'游引物 0,5μΙ i〇x PCR Buflcr 1·5μ1 2 nimol/L dNTP 1·5μ1 25 mraol/L MgCl? 1 ·2μ1 5 U/ul Taq Si 0.18μ1 ddH20 8.62μ1 ?〇?扩增条件为：941：预变性51^11;941：变性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸3〇8，共30 个循环，再72°C延伸5min，4°C保温。
【文档编号】C12Q1/68GK104293972SQ201410631874
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】户国, 郭媛, 王炳谦, 谷伟, 孙鹏 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所