一种检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂盒。本发明的试剂盒中至少包括SrMV-CPF和SrMV-CPR简并引物对，试剂盒内还有RT反应液、PCR反应液、限制性内切酶反应液、ExTaq酶液、 Nsi I内切酶、 Bsm I内切酶、阳性样品RNA、阴性样品RNA和无核酸酶无菌水。本发明的引物具有特异性，限制性内切酶条带长度多态性具有唯一性，为侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒检测和鉴定提供了一种简便、快速、准确的方法。采用本发明试剂盒提供的试剂，经检测可判定是否感染高粱花叶病毒及其基因型类型。
【专利说明】一种检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测和鉴定高粱花叶病毒的试剂盒，具体涉及一种检测和鉴定侵 染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂盒。
【背景技术】
[0002] 自1892年Musschenbroek在爪挂首次记述了甘鹿花叶病以来，目前在全世界种 植甘蔗的国家普遍发生，并成为甘蔗重要病害之一。感病植株一般出现黄绿相间不规则的 花纹、条斑或斑驳，长短、大小不一，布满整个叶片，尤以新叶基部症状最为明显。感病植株 叶片黄化，植株矮化，分蘖减少，节间缩短，造成甘蔗产量及蔗茎含糖量降低。引起甘蔗花叶 病的病原有3种，即马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的甘鹿花叶病毒mosaic Firtts, SCMV)、高梁花叶病毒fflosaic Fi/Y/ASrMV)和马铃薯Y病毒科ZbaceFirw1S 属的甘鹿条纹花叶病毒Siripe mosaic rirw^SCSMV)。根据我们前期研究表 明，SrMV是引起我国糖料甘蔗花叶病的主要病原。
[0003] 甘蔗花叶病的诊断可以初步通过叶片的病害症状特征来识别，但症状表现与甘蔗 品系、生长条件、温度和病毒株系有关，有些感病植株没有表现出花叶的症状，出现隐症现 象。SCMV、SrMV、SCSMV等3种不同的病毒种可以混合侵染甘蔗，即使某一种病毒单独侵染， 也难于通过症状的表现来把这3种病毒区分开来，更何况是同一病毒种的不同株系(或基 因型)。这些局限性给甘蔗花叶病田间诊断带来困难。甘蔗花叶病病原鉴定和检测的技术 有电镜诊断、组织印迹杂交免疫测定（TBIA)、酶联免疫测定技术（ELISA)、常规RT-PCR和实 时荧光RT-PCR法等。上述的血清学检测方法能够判定是否感染这3种病毒，但是，各种生 化和血清学技术很难区分出某一病毒的具体基因型，而且需要特异性很好的抗体。宿主反 应是可以用来区分不同病毒株系，但这种方法很耗费时间和劳力。病毒外壳蛋白（CP)基因 序列差异是马铃薯Y病毒科中病毒种的分类标准之一，其生化特性能很好的区别马铃薯Y 病毒属甘蔗花叶病毒亚组不同株系，因此，RT-PCR分子鉴定技术常用于研究侵染甘蔗的马 铃薯Y病毒科的病毒分类。根据SrMV的CP序列来鉴定侵染甘蔗的SrMV不同分离物国内 外已有报道，但是，这种常规分子检测方法需要将PCR产物回收、转化到大肠杆菌DH5 α，然 后通过测序和序列分析，实验步骤较为繁琐、耗费时间较长。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂 盒。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 本发明的一种检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂盒，提供一对特异 性简并引物SrMV-CPF和SrMV-CPR，其序列如下： SrMV-CPF :5' -ACADCAGADGCAACRGCACAAGC-3'，其中，D=A或G或 T，R= A或G ;SrMV-CPR : 5' -CTCRCCGACATTCCCATCYAAGCC-3'，其中，R=A 或 G, Y=C 或 T ; 本发明发明的一种检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂盒，其特征在 于该试剂盒由下列试剂组成： (1) RT反应液：每个反转录反应液包括5XRT缓冲液2. O μ UAMV反转录酶液0.5 μ L、 10 ymol/L SrMV-CPR 引物 2.5 yL、100 ymol/L 随机 6 聚体引物 2.0 yL、共 5.0 μ?，50 个反应体系共计250 μ?，-20 °C保存备用； (2) PCR反应液：每个PCR反应液包括10XPCR缓冲液5.0 μ?、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 KU以及浓度为10 Mmol/L的简并引物SrMV-CPF和SrMV-CPR各2.0 μ?，共11.0 μ?，50个 反应体系共计550 μ?，-20 °C保存备用； (3) 限制性内切酶缓冲液：每个酶切反应液包括IOX酶切缓冲液4. 0 μ?，50个反应体 系共计200 μ?，-20 °C保存备用； (4) Ex Taq酶：每个PCR反应体系包括5 U/μ? Ex Taq酶0.25 μ?，50个反应体系共计 12. 5 μ?，-20 °C 保存备用； (5) Afei I内切酶：每个限制性内切酶反应体系包括10 U/μ? AfeiI内切酶1. 5 μ?，50 个反应体系共计75 μ?，-20°C保存备用； (6) 没s? I内切酶：每个限制性内切酶反应体系包括10 U/μ?没内切酶1. 5 μ?，50 个反应体系共计75 μ?，-20°C保存备用； (7) 阳性样品RNA :采用T7 RNA聚合酶体外转录合成含有不同高粱花叶病毒基因型靶 片段的RNA作为标准样品，I X IOltl拷贝/>L，50 μ?7瓶，-20 °C保存备用； (8) 阴性样品RNA :采用无高粱花叶病毒感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总RNA为阴性 对照，100 ng/^L，50 μ?7 瓶，-20 °C保存备用； (9) 无核酸酶无菌水：2XlO mL/瓶。 本发明的优点：本发明的优点是通过限制性内酶将RT-PCR产物酶切，然后电泳检测限 制性内切酶片段长度多态性，就可以快速鉴定出侵染甘蔗的高粱花叶病毒不同的基因型， 这种鉴定方法克服常规分子检测和鉴定方法的不足之处，省略了常规分子检测方法中PCR 产物回收直至测序和序列分析的步骤，大大缩短了 RT-PCR的检测时间，并且降低检测成 本，更符合实际的需求，应用前景广阔。本发明的引物具有特异性，限制性内切酶条带长度 多态性具有唯一性，为高粱花叶病毒检测和鉴定提供了一种简便、快捷、准确的方法。根据 本发明试剂盒提供的试剂，待检测的感病植株总RNA样品经过RT-PCR扩增、用Afei I和你? I限制性内切酶酶切反应，用4%的低熔点琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据限制性内切 酶条带长度多态性可判定是否感染高粱花叶病毒及其基因型类型。
【专利附图】
【附图说明】
[0006] 图1是侵染甘蔗的高粱花叶病毒不同株系的电泳检测图，其中，1为DL 1000 bp DNA标准相对分子质量，2为SrMV-Gl基因型，3为SrMV-G2基因型，4为SrMV-G3基因型，5 为 SrMV-G4-A，6 为 SrMV-G4-B、7 为 SrMV-G4-C、8 为 SrMV-G4-D，9 为 SrMV-G5 基因型，10 为 SrMV-G6基因型，11为阴性样品（不含SrMV病毒)，12为空白对照，13为20 bp DNA标准相 对分子质量。
【具体实施方式】
[0007] 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施 例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可 从商业途径获得。
[0008] 1、甘蔗叶片总RNA提取 1)从我国各省（区）的蔗区收集了 104份田间甘蔗叶片样品，-80 °C保存备用。
[0009] 2)称取0. I g甘蔗叶片，并用液氮研磨成粉末。
[0010] 3)向I. 5 mL离心管中加入粉末，在液氮刚挥发完时立即加入I mL TRIZOL试剂， 盖上管盖，震荡混匀，于4 °C、12000 rpm离心10 min。
[0011] 4)吸取上清液至另一新的离心管中，加入0.2 mL氯仿，盖住管盖，振荡混匀，室温 静置 3 min 后，于 4 °C、12000 rpm 离心 15 min。
[0012] 5)吸取上清液至另一新的离心管中，加入0. 5 mL预冷的异丙醇（_20°C)，颠倒混 匀，室温静置10 min后，于4 °C、12000 rpm离心15 min (离心管开口保持朝离心机转轴方 向放置)。
[0013] 6)倒出离心管中上清液，加入I mL体积比为75 %的预冷乙醇（_20°C)洗涤，颠 倒离心管2?3次，7500 rpm离心5 min (离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。重复 洗涤沉淀1次。
[0014] 7)倒出离心管中上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不 要碰到有沉淀的一面，室温干燥10?15 min。
[0015] 8)加入50 μ L无核酸酶无菌水，混匀，溶解管壁上的RNA，2 000 g离心5 s，冰上 保存备用。提取的RNA应在2 h内进行RT-PCR扩增；若需长期保存，应放置-80 °C冰箱。
[0016] 9)在核酸蛋白分析仪上测定RNA的光吸收值，计算提取的RNA浓度。
[0017] 2、简并引物设计 本发明的扩增引物应用相关的引物设计软件对根据高粱花叶病毒基因组外壳蛋白CP 序列设计，再从获得的几十对引物中选择评分较高的引物对，再将设计好的引物序列发送 至生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成得到。最终确定简并引物序列设计简并引 物序列SrMV-CPF和SrMV-CPR，扩增的目的核酸带大小接近900 bp，简并引物序列如下： SrMV-CPF :5' -ACADCAGADGCAACRGCACAAGC-3'，其中，D=A、或 D=G、或 D=T ;R= A 或 R=G ; SrMV-CPR :5' -CTCRCCGACATTCCCATCYAAGCC-3'，其中，R=A 或 R=G，Y=C 或 Y=T ; 3、RT-PCR 扩增 应用本试剂盒提供的RT反应液进行反转录反应，在PCR管中加入以下试剂：
【权利要求】
1. 一种检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂盒，包括一对简并引物 SrMV-CPF 和 SrMV-CPR，SrMV-CPF 的序列为 5' -ACADCAGADGCAACRGCACAAGC-3'，其中，D=A、 或 D=G、或 D=T ;R= A 或 R=G ;SrMV-CPR 的序列为 5' -CTCRCCGACAITCCCATCYAAGCC-3'，其中， R=A 或 R=G,，Y=C 或 Y=T。
2. -种如权利要求1所述的检测和鉴定侵染甘蔗的不同高粱花叶病毒基因型试剂盒， 其特征在于该试剂盒由下列试剂组成： (1) RT反应液：每个反转录反应液包括5 X RT缓冲液2.0 yL、AMV反转录酶液0.5 yL、 10 iimol/L SrMV-CPR 引物 2. 5 iiL、共 5. 0 ML，50 个反应体系共计 250 ML，-20 °C保存备 用； (2) PCR 反应液：每个 PCR 反应液包括：10XPCR 缓冲液 5. 0 ML、2. 5 mmol/L dNTPs 4. 0 ML、以及浓度为10 Mmol/L的简并引物SrMV-CPF和SrMV-CPR各2.0 ML，共11.0 ML，50个 反应体系共计550 ML，-20 °C保存备用； (3) 限制性内切酶缓冲液：每个酶切反应液包含IOX酶切缓冲液4. 0 ML，50个反应体 系共计200 ML，-20 °C保存备用； (4) Ex Taq酶：每个PCR反应体系包括5 U/ML Ex Taq酶0.25 ML，50个反应体系共计 12. 5 ML，-20 °C 保存备用； (5) Afei I内切酶：每个限制性内切酶反应体系包括10 U/ML AfeiI内切酶1. 5 ML，50 个反应体系共计75 ML，-20°C保存备用； (6) 没s? I内切酶：每个限制性内切酶反应体系包括10 U/ML没内切酶1. 5 ML，50 个反应体系共计75 ML，-20°C保存备用； (7) 阳性样品RNA :采用17 RNA聚合酶体外转录合成含有不同高粱花叶病毒基因型靶 片段的RNA作为标准样品，I X IOltl拷贝/ML，50 ML/瓶，-20 °C保存备用； (8) 阴性样品RNA :采用无高粱花叶病毒感染的甘蔗叶片组织，提取叶片总RNA为阴性 对照，100 ng/ML，50 ML/瓶，-20 °C保存备用； (9) 无核酸酶无菌水：2XlO mL/瓶。
【文档编号】C12Q1/68GK104313189SQ201410639179
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】高三基, 孙生仁, 高钰, 曹敏嘉, 陈如凯, 傅华英, 肖胜华, 陈曦 申请人:福建农林大学