一种致病疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种致病疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为致病疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于致病疫霉菌的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，能够对田间土壤中的病原物进行检测，本发明对马铃薯、番茄的晚疫病防治和对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。
【专利说明】-种致病疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂 盒和LAMP检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种致病疫霉的LAMP检测引物组合物及其 LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
【背景技术】
[0002] 致病疫霉（Phytophthora infetans)是疫霉属发现的第一个种，能够引起马铃薯 晚疫病，主要侵染马铃薯、番茄等多种农作物，造成严重减产甚至绝收。马铃薯晚疫病是导 致马铃薯块茎腐烂和茎叶死亡的一种毁灭性卵菌病害，是严重影响马铃薯产量、品质和产 业化发展的世界性病害，1847年在爱尔兰曾因该病的大发生使马铃薯歉收而导致大饥荒。 致病疫霉一直是马铃薯和番茄生产上的最严重的病害之一，近年来，马铃薯晚疫病在我国 有逐年加重的趋势，其危害性、防治难度及对社会造成的影响已经超过了水稻稻瘟病和小 麦条锈病，被视为世界第一大作物病害，特别是近年来由于抗病品种的推广、交配型的出现 以及病菌的迁移，新的基因型群体取代了旧的基因型群体，形成了更具侵染力和适合度更 高的生理小种，使得晚疫病的控制异常困难，其危害也越来越严重，因此应该引起高度重 视。为了阻止致病疫霉传播范围的不断扩大，使致病疫霉引起的晚疫病得到控制，需要对其 进行快速、准确地检测。
[0003] 传统的致病疫霉的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征 等。传统方法在致病疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业 的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，PCR技术为 植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提 高，但是检测时间仍然比较长，大概4?5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检 测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
[0004] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本 的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等 优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异 的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围80min内，大 量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程 依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下 进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP 反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立 14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植 物病原卵菌的检测报道很少，致病疫霉菌的检测国内外均未见报道。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中致病疫霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异 性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种致病疫霉菌的LAMP检测引物组合物。本 发明的另一目的是提供上述致病疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明还有一目的是提供上 述致病疫霉菌的LAMP检测方法。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种用于检测致病疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引 物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：
[0008] FIP:5， -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3，；
[0009] BIPiSi -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3/ ；
[0010] F3:5， -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3';
[0011] B3 :5，-GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3，；
[0012] LB:5，-GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-S，。
[0013] 所述的LAMP检测引物组合物在检测致病疫霉菌的中的应用。
[0014] 一种检测致病疫霉菌的LAMP检测试剂盒：包含ImL检测溶液，所述的检测溶液包 括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM 环引物 LF、8mM 环引物 LB、56mM dNTPs、0. 8M Tris-HC、0. 4mMKCl、0. 4mM(NH4) 2S04、0. 24mM MgS04、4% Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 单位，180mM 羟基萘酚蓝；其中，各引物 序列具体如下：
[0015] FIP:5， -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3，；
[0016] BIPiSi -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3/ ；
[0017] F3:5，-TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3';
[0018] B3:5，-GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3，；
[0019] LB:5，-GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-S，。
[0020] 所述的检测致病疫霉菌的LAMP试剂盒在检测致病疫霉菌的中的应用。
[0021] 一种检测致病疫霉菌的LAMP检测方法：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA 为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存在致病 疫霉菌；无特征性阶梯状条带，则所检测样品中无致病疫霉菌；或观察LAMP反应溶液颜色 变化，天蓝色表示检测为阳性，存在致病疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在致病疫 霉菌。
[0022] 所述的检测致病疫霉菌的LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取1 μ L DNA溶 液，加入23 μ LLAMP试剂盒中的检测溶液和1 μ L灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序 为：6(TC?65°C，55 ?85min。
[0023] 本发明的检测致病疫霉菌的方法，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模 板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检 测结果（羟基萘酚蓝不会影响电泳结果），如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品 中存在致病疫霉菌；轻基萘酚蓝（hydroxylnaphthol blue，HNB)属于金属离子指示剂的一 种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系 中Mg 2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反 应体系呈紫色，反应过程中Mg 2+与LAMP反应的副产物P2 074_结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+ 浓度降低，pH发生变化,从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应 体系的颜色变化，来判断致病疫霉的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在致病疫霉菌；紫色 表示检测结果为阴性，不存在致病疫霉菌。
[0024] 本发明的关键性技术之一是致病疫霉的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。 为了验证致病疫霉的特异性引物序列，本发明以我国江苏、山东和福建等省份的30株致病 疫霉菌株和13种其它卵菌以及19种病原真菌为供试材料（表1)，采用CTAB法提取发病组 织中致病疫霉的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩涡混匀，于55°C水浴lh，中间每IOmin上下颠倒几次。12000rpm离心lOmin，取 上清加等体积酚/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，颠倒混匀，12000rpm离心IOmin ;将上清转移 至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混勻，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积 的无水乙醇和 1/10 体积的 3M NaAc (pH 5. 2)，-20°C沉淀（>lh)。12000rpm 离心 IOminJtIi 去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE (pH 8.0)溶解沉淀 (含20μ8/ιΛ RNase)，37°C处理Ih后，-20°C保存备用。所有的土壤样品采用FastDNAw SPIN试剂盒（Q-Biogene Ltd, USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明 书。这一商用土壤微生物DNA提取试剂盒可以在0. 5h内提取到土壤中的微生物。
[0025] 当发生LAMP扩增反应时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升， 通过HNB的显色反应结果所示，致病疫霉菌的反应管均呈天蓝色，其为阳性结果，而其它疫 霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果，证明所设计的LAMP特异性引 物具有种的特异性。同时，反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，成像观察扩增的反应产物，致 病疫霉菌的反应管中的反应液出现了典型阶梯形状条带，而其它疫霉种、真菌、腐霉和阴性 对照菌反应管没有出现梯形条带。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织及土壤中 致病疫霉菌的快速可靠的检测盒鉴定。当用于发病组织中存在致病疫霉菌时，采用NaOH快 速裂解法提取致病疫霉菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入 IOyL 0. 5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取 5yL上清液加入495yL 0. ImM Tris(pH8. 0)，混匀后取IyL直接用于PCR反应。每个反 应至少重复三次，同时为确定植株中无 PCR抑制物存在。
[0026] 表1用于检测致病疫霉特异性的真菌和卵菌菌株
[0027]
【权利要求】
1. 一种用于检测致病疫霉菌的LAMP引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向 内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下 ： FIP:5, -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3,; BIP:5' -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3'; F3:5' -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3'; B3:5' -GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3^ ; LB:5, -GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-3,。
2. 权利要求I所述的LAMP引物组合物在检测致病疫霉菌的中的应用。
3. -种检测致病疫霉菌的LAMP试剂盒，其特征在于：包含ImL检测溶液，所述的检测 溶液包括：32 mM正向内引物FIP、32 mM反向内引物BIP、8 mM正向外引物F3、8 mM反向外 引物B3、8 mM环引物LB、56 mM dNTPs、0.8 M Tris-HC、0.4 mM KC1、0.4 mM (NH4)2S04、0.24 mM MgS04、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 单位，180mM 羟基萘酚蓝；其中，各引 物序列具体如下： FIP:5, -AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3,; BIP:5' -TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3'; F3:5' -TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3'; B3:5' -GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3^ ; LB:5, -GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-3,。
4. 权利要求3所述的检测致病疫霉菌的LAMP试剂盒在检测致病疫霉菌的中的应用。
5. -种检测致病疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待检微生物的DNA，以提取的 DNA为模板，利用LAMP引物组合物或LAMP试剂盒进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存在致病疫 霉；无特征性阶梯状条带，则所检测样品中无致病疫霉；或观察LAMP反应溶液颜色变化，天 蓝色表示检测为阳性，存在致病疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在致病疫霉菌。
6. 根据权利要求5所述的检测致病疫霉菌的方法，其特征在于：提取待检微生物的 DNA，取I ii L DNA溶液，加入23 ii LLAMP试剂盒中的检测溶液和I ii L灭菌去离子水进行 LAMP，LAMP反应程序为：60°C?65°C，55~85min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下 检测结果。
【文档编号】C12R1/645GK104313175SQ201410639817
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】戴婷婷, 郑小波, 吴小芹 申请人:南京林业大学