一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法。本发明首先采用物理研磨配合化学酶法离散鸡肠道上皮细胞，提高了肠道细胞离散程度，缩短了细胞处理时间，保证了细胞的高活性；最佳密度细胞分离液的使用，保证了肠道上皮淋巴细胞的纯化；磁珠二抗分选法的使用，确保了目标细胞较高的纯净度；并经过细胞培养，发现本发明分离培养所得的目标细胞纯度高达90％。本发明解决了分离培养鸡肠道上皮γδT细胞过程中种种弊端，从而为鸡肠道上皮γδT细胞培养及其生物学和免疫学研究奠定基础。
【专利说明】-种鸡肠道上皮Y 6 T细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] Y 5 T细胞是近20年人们新认识的1种T细胞亚群，其在机体出现异常变化时 做出的反应比a目T细胞更为迅速。与人和其他哺乳动物外周血中只有很少比例（3%? 5%)，Y S T细胞不同，家禽外周血中Y S T细胞占到约50%左右。在受到病原体入侵时，家 禽黏膜上皮和外周血中的Y 5T细胞在机体初期防御中发挥重要作用。但是长期W来鸡肠 道上皮Y 5T细胞的分离培养一直较为困难。传统研究多集中于体外扩增淋己细胞并选择 性计数Y 5 T细胞（董思源.Y 5 T细胞体外扩增，i-IELs分离和免疫英光技术的建立.天 津：南开大学，2011)，该种方法并未将Y 5T细胞与其他淋己细胞分离开。由于Y 5T细 胞的增殖受到多种淋己细胞分泌的细胞因子的影响，而且体外扩增过程已将Y 5T细胞活 化，故传统方法并不能完全独立研究其静息态下的生物、免疫活性及其激活机制。利用分离 自21?35日龄肉仔鸡肠道上皮Y 5 T细胞进行体外分离培养试验，与之相比，具有明显的 优点。该方法分离出的肠道上皮Y 5 T细胞，不受机体肠道其他淋己细胞的影响，不受肠道 食糜中某些活性成分的刺激，并能保持较静息态和一定程度的特异性和免疫性，本方法的 建立有利于肉仔鸡肠道中该细胞进一步研究。因此，鸡肠道上皮Y 5T细胞分离培养方法 的建立，为研究鸡肠道上皮Y 5T细胞生物学和免疫学奠定了基础。
[0003] 鸡肠道上皮细胞的离散是本方法的重要环节。常用方法为剪碎肠道壁后，消化酶 消化，但消化酶价格昂贵，然其种类和用量均难确定，处理时间也难W把握。该为肠道上皮 淋己细胞的分离带来了很大的困难。
[0004] 鸡肠道上皮淋己细胞的分离是本方法的又一重要环节。由于淋己细胞分离液密度 不合适，往往造成分离细胞纯度不高，肠道上皮细胞大量混杂其中。进而大大浪费了下一步 操作中抗体和磁珠的用量，增加操作成本。
[0005] 此外，对鸡肠道上皮Y 5T细胞研究，常用方法为混合淋己细胞培养，给予目标刺 激后，研究其增殖情况及生物免疫活性。但Y 5T细胞增殖活化与其他淋己细胞分泌的细 胞因子及其接触的肠道上皮细胞都有密切关系。混合培养，并不能清晰反映目标刺激对 Y 5 T细胞的直接作用，为Y 5 T细胞研究带来较大问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种鸡肠道上皮Y 5T细胞的 分离培养方法，降低细胞分离过程中的污染风险和成本，减少因分离时间过长带来的诸多 弊端，同时，能够提高目标细胞的纯度。
[0007] 本发明解决的上述技术问题所采用的技术方案为：
[0008] 1. -种鸡肠道上皮Y 5T细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括W下步 骤：
[0009] 步骤I ;由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2?3cm肠段置于含 1 %双抗的PBS中；
[0010] 步骤2 ;制备肠壁组织浆液经离也去上清液后，于沉淀中加入0. 05 %胶原酶混合 酶进行消化；
[0011] 步骤3 ;向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，离也；去上清，无血清培 养液重息细胞，离也洗涂细胞；再次重息细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离 也去上清；
[0012] 步骤4 ;将细胞重息于密度为1.058g/mL淋己细胞分离液中；于离也管底部加入 4mL密度为1. 098g/mL淋己细胞分离液；将细胞息液铺于之上，离也；取两个不同密度的淋 己细胞分离液界面黄白色细胞层；
[001引步骤5 ;在浓度为IX IOVmL细胞息液中，先后加入一定量的TCRl抗体和磁珠，进 行磁珠二抗分选，并用PBS适当重息稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞息液置于细胞 分选仪进样口，得到阳性细胞；
[0014] 步骤6;将细胞息浮于10%胎牛血清1?^1-1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞 数，调整细胞浓度为1 X lOVmL，于二氧化碳培养箱培养4她后，测定其细胞存活情况。
[0015] 2.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，其特征是所述 步骤1中的双抗为青霉素和链霉素，浓度为1% (V/V)。
[0016] 3.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，其特征是步骤 1所述的肠段为空肠中段。
[0017] 4.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，其特征是步骤 2中所述的混合消化酶为胶原酶I和胶原酶IV混合酶制剂其质量比为为2:1。
[0018] 5.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，其特征是所述 的步骤3中无血清1?^1-1640培养液为1?^1-1640细胞培养基中加入（￥/^)0.5%双抗、1% k谷氨醜胺和1 %轻己基脈嗦己賴酸，pH 7. 2?7. 4。
[0019] 6.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，其特征是所述 的步骤4不同密度淋己细胞分离液，经过密度为1. lOlg/mL的淋己细胞分离液原液与PBS 一定比例配制而得。
[0020] 7.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，其特征是所述 的步骤5中的磁珠二抗分选法，具体为先加入一定量TCRl抗体，保证其浓度可达每IO 7个 细胞息液中含有20 y L抗体；赔化后，离也去上清；再加入磁珠，使其浓度达到每IO7个细胞 息液中含有5 y L磁珠，赔化离也去上清；PBS重息细胞，进行细胞分选仪分选。
[0021] 8.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法，其特征是所述 的步骤1中的禁食时间，24?36h为最佳禁食时间。
[0022] 本发明的详细描述：
[0023] 鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法包括W下步骤：
[0024] 步骤1 ;对21?35日龄肉仔鸡禁食24?36h，静脉放血处死，75%酒精浸泡10? 15min ;0. 1%新洁尔灭浸泡5?lOmin。取出肉仔鸡绑定，75%酒精消毒仔鸡腹腿部，破开 腹腔；双抗溶液喷于腹部各器官表面，手术綴找到空肠中段，取2?3cm肠段于1 %双抗PBS 溶液中（V/V)。
[00巧]步骤2 ;将溶液移入超净台，纵向剪开肠壁，1%双抗PBS溶液中冲洗，移入无双抗 PBS溶液冲洗，手术剪剥离肠壁脂肪和结缔组织，移入无双抗PBS溶液，手术剪将肠壁剪为 浆糊状，玻璃研磨器小也研磨；将组织匀浆液移入离也管，离也；去除上清，加入胶原酶I 和胶原酶IV混合酶制剂佑IBCO公司）（质量比为2:1)，37°C，5% C〇2,摇床震荡15min。
[0026] 步骤3 ;向细胞液加入无血清RPMI-1640细胞培养液（其中按体积比加入了 0. 5% 双抗、1 % k谷氨醜胺和1 %轻己基脈嗦己賴酸，抑调至7. 2?7. 4)终止消化，离也；去上 清，无血清RPMI-1640培养液重息细胞，离也洗涂细胞；再次重息细胞，分别经过100目，200 目自制细胞筛（自制细胞筛为经100目和200目網布紧固于烧杯而成），离也去上清。
[0027] 步骤4 ;将细胞重息于密度为1.058g/mL淋己细胞分离液中；在离也管底部加入 4mL密度为1.098g/mL的淋己细胞分离液（不同密度淋己细胞分离液，经过密度为1. IOlg/ 血淋己细胞分离液原液订抓Science公司）与PBS-定比例配制而得）；将细胞息液铺于 之上，离也；取两个不同密度的淋己细胞分离液界面黄白色细胞层，无血清RPMI-1640培养 液重息细胞，离也去上清，洗涂，即为肠道上皮淋己细胞；显微镜下计数细胞，约为1 X IOV 血，细胞活率95% W上。
[002引 步骤5 ;在浓度为1 X IOVmL细胞息液中加入鼠抗鸡TCRl抗体（Souther Biotech 公司），轻轻混匀，赔化lOmin，离也去上清；PBS重息细胞，使细胞浓度达到I XioVu L， 加入磁珠，赔化15min，离也去上清；PBS重息细胞5 X lOVmL ;将细胞息液置于细胞分选仪 (Milteny Biotec GmbH公司，型号：autoMAC巧进样口，得到阳性细胞，进行培养。
[0029] 步骤6 ;将细胞息浮于RPMI-1640完全培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数 (>95% )，调整细胞浓度为IX lOVmL。之后于96孔细胞培养板，每孔植入190 UL细胞息 液，随后加入刀豆球蛋白ConA(终浓度为5y g/mL)，培养体系为200UL。置5% C02,4(TC 二氧化碳培养箱培养4她，MIT法染色细胞，用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定OD值。
[0030] 本发明涉及一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法。与目前常用的混合培养 研究鸡肠道上皮Y 5T细胞相比，本发明关于一种鸡肠道上皮Y 5T细胞的分离培养方法 有较大的创新性和独特性，建立了成熟的鸡肠道上皮Y 5T细胞的分离培养方法，分离得 到了纯度高且原始静息的鸡肠道上皮Y 5T细胞，减少了分离过程的污染风险，缩短了分 离所需的时间，保证了分离过程中细胞的活力。该方法的建立有利于独立研究鸡肠道上皮 Y 5T细胞的生物活性和免疫活性。
[0031] 本发明中的鸡肠道上皮淋己细胞的分离，采用了物理轻微研磨和化学酶消化相结 合的方法。物理研磨分离细胞的弊端在于极易破坏细胞膜，减弱细胞活性，但其可缩短分离 时间；化学处理方法温和，但酶的种类、浓度W及处理时间难W确定，该样同样带来抑制细 胞活性的弊端。本发明先采用物理轻微研磨，即将剪碎的肠道上皮移入玻璃研磨器，轻且慢 研磨两次，每次时间不超过IOs ;该步骤提高了细胞分离的效率，损伤细胞的程度较小；为 化学消化奠定了基础。将物理研磨后的细胞移入培养皿中，加入终浓度为0. 05%的胶原酶 I和胶原酶IV混合酶制剂，37C，5% (?,置于摇床震荡15min，即可看见离散较好的细胞。 酶消化法较为温和，不易直接损伤细胞，加之之前的物理消化方法，可在较短时间内得到活 力较好的细胞。物理研磨加之化学酶消化，得到了离散较好，活力较好的鸡肠道上皮细胞。
[0032] 密度梯度分离肠道淋己细胞，利用较为精准的密度淋己细胞分离液，得到了纯度 较高的淋己细胞，从而去除了含量较高的肠道上皮细胞及其它杂细胞。
[0033] 磁珠二抗淋己细胞分选仪分选，得到纯净的鸡肠道上皮的Y 5T细胞。先将得到 的肠道上皮淋己细胞与鼠抗鸡TCRl -抗赔化，使TCRl与目标细胞表面的Y 5抗原结合， 之后加入磁珠赔化，使TCRl与磁珠结合，经由分选仪的磁性分选，得到阳性细胞，即为目标 细胞Y 5 T细胞。磁珠二抗分选方法，解决了鸡肠道上皮Y 5 T细胞分离纯度差的问题。使 广大科研工作者可W独立研究鸡肠道上皮Y 5T细胞。
[0034] 本发明的有益效果
[00巧]本发明涉及一种鸡肠道上皮Y 5 T细胞的分离培养方法。本发明首先采用物理研 磨配合化学酶法离散鸡肠道上皮细胞，提高了肠道细胞离散程度，缩短了细胞处理时间，保 证了细胞的高活性；最佳密度细胞分离液的使用，保证了肠道上皮淋己细胞的纯化；磁珠 二抗分选法的使用，确保了目标细胞较高的纯净度；并经过细胞培养，发现本发明分离培养 所得的目标细胞纯度高达90%。本发明解决了分离培养鸡肠道上皮Y 5T细胞过程中种种 弊端，从而为鸡肠道上皮Y 5T细胞培养及其生物学和免疫学研究奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1 ;新分离的肉仔鸡肠道上皮Y 5 T细胞图中显示分离得到的肉仔鸡肠道上皮 Y 5T细胞（IXioVmL)D
[0037] 图2 ;培养4她的肉仔鸡肠道上皮Y 5T细胞图中显示培养4她后的肉仔鸡肠道 上皮Y 5T细胞巧X107mL)。
【具体实施方式】
[0038] 为了进一步说明本发明的内容，下面结合本发明的实施例作进一步详细描述。
[0039] 实施例1
[0040] 本实施例W 30日龄1. 5kg健康白羽肉鸡分离培养肠道上皮Y 5 T细胞。先进行 2化的禁食，部污物皮屑，去除腹部及腿部羽毛，浸泡15min ;再于0. 1 %新洁尔灭溶液中浸 泡IOmin;取出肉仔鸡，绑定于手术台上，75%酒精喷于仔鸡腹腿部，破开腹腔；1%双抗溶 液喷于腹部各器官表面，手术綴找到空肠中段，取3cm肠段于1 %双抗PBS溶液中。
[0041] 将溶液移入超净台，纵向剪开肠壁，1 %双抗PBS溶液中測洗H次，移入无双抗 PBS溶液測洗两次，手术剪剥离肠壁脂肪和结缔组织，移入无双抗PBS溶液，手术剪将肠壁 剪为浆糊状，玻璃研磨器小也研磨2次；将组织匀浆液移入15mL离也管，25(K)r/min，离也 IOmin ;去除上清，加入5血0. 05%胶原酶混合酶液，37°C，5% (?,置于摇床震荡15min。
[0042] 向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，25(K)r/min，离也IOmin ;去上 清，无血清RPMI-1640培养液重息细胞，离也洗涂细胞；再次重息细胞，分别经过100目，200 目自制细胞师，贸也去上清。
[0043] 将细胞重息于密度为1. 058g/mL淋己细胞分离液（配制方法同上）；在15血离也 管底部加入4mL密度为1. 098g/mL的淋己细胞分离液；将细胞息液铺于之上，30(K)r/min， 20min离也；取两个不同密度的淋己细胞分离液界面黄白色细胞层，无血清RPMI-1640培养 液重息细胞，离也去上清，洗涂H次，即为本发明所制备的鸡肠道上皮Y 5 T细胞（肠道上 皮淋己细胞）；显微镜下计数细胞，约为IXioVmU活率95% W上。
[0044] 将细胞息液离也去上清，PBS重息细胞，使细胞浓度达到IXioVmU加入鼠抗鸡 TCRl -抗，轻轻混匀，保证其浓度可达每IO7个细胞息液中含有20 y L抗体，4°C赔化lOmin， 250化/min,离也IOmin去上清；PBS重息细胞，再加入磁珠，使其浓度达到每IO7个细胞息液 中含有5 U L磁珠，4°C赔化15min，2500r/min，离也IOmin去上清；PBS重息细胞5 X IOVmL ; 将细胞息液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞。
[0045] 收集细胞后，台盼蓝染色，计数活细胞数（>95%)，调整细胞浓度为IX 1〇7个/mL。 之后于96孔细胞培养板，每孔植入190 y L细胞息液，随后加入刀豆球蛋白Con A (终浓度 为5 y g/血)，培养体系为200 y L。置5% C〇2,4(TC二氧化碳培养箱培养4她，每孔轻轻吸弃 上清10011^加入100111不含小牛血清的1?^1-1640培养基，同时加入5111肖/1111^11'1'溶液 100 U L，继续培养化，培养结束后，每孔加入100 y L DMSO溶液，静置10-15min，使紫色结晶 完全溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定OD值。
[0046] 实施例2
[0047] --本发明的方法与传统方法对比试验
[0048] 对比实验采用传统的0. 05%胶原酶IV消化，37°C，5% C〇2,置于摇床震荡45min， 促使细胞完全离散。之后经过密度梯度离也，采用磁珠二抗分选后，得到鸡肠道上皮淋己细 胞，检测细胞活力。
[0049] 发明人使用本方法及对比实施例所述方法，均作了十次试验进行比较，并进行了 细胞分离情况的数据统计，如表1比较：
[0050] 表1本发明的方法与传统方法分离细胞对比试验
[0051]
【权利要求】
1. 一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 步骤1 :由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2?3cm肠段置于含1% 双抗的PBS中； 步骤2 :制备肠壁组织浆液经离心去上清液后，于沉淀中加入0. 05%胶原酶混合酶进 行消化； 步骤3 :向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液 重悬细胞，离心洗漆细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去 上清； 步骤4 :将细胞重悬于密度为1. 058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密 度为1. 098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞 分离液界面黄白色细胞层； 步骤5 :在浓度为1 X 107/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁 珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选 仪进样口，得到阳性细胞； 步骤6 :将细胞悬浮于10%胎牛血清RPMI-1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调 整细胞浓度为1 X 107/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。
2. 如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征是所述步骤 1中的双抗为青霉素和链霉素，浓度为1% (V/V)。
3. 如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征是步骤1所 述的肠段为空肠中段。
4. 如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征是步骤2中 所述的混合消化酶为胶原酶I和胶原酶IV混合酶制剂其质量比为为2:1。
5. 如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征是所述的 步骤3中无血清RPMI-1640培养液为RPMI-1640细胞培养基中加入（V/V)0. 5%双抗、1% L-谷氨酰胺和1 %羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7. 2?7. 4。
6. 如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征是所述的步 骤4不同密度淋巴细胞分离液，经过密度为1. 101g/mL的淋巴细胞分离液原液与PBS -定 比例配制而得。
7. 如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征是所述的步 骤5中的磁珠二抗分选法，具体为先加入一定量TCR1抗体，保证其浓度可达每107个细胞 悬液中含有20 y L抗体；孵化后，离心去上清；再加入磁珠，使其浓度达到每107个细胞悬液 中含有5 y L磁珠，孵化离心去上清；PBS重悬细胞，进行细胞分选仪分选。
8. 如权利要求1所述一种鸡肠道上皮Y ST细胞的分离培养方法，其特征是所述的步 骤1中的禁食时间，24?36h为最佳禁食时间。
【文档编号】C12N5/0783GK104357393SQ201410645751
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】张海军, 杨金玉, 武书庚, 齐广海, 岳洪源, 王晶 申请人:中国农业科学院饲料研究所