一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型f200y菌株的分子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种对快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子检测方法，以基于环介导恒温扩增技术(LAMP)建立起来的一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高和成本低廉的分子检测技术。该检测方法通过在灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的β微管蛋白上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株。LAMP扩增产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，有产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性基因型F200Y菌株；LAMP扩增产物显示为紫色，电泳图谱无条带，无产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的非抗性基因型F200Y菌株。本发明简便、快速、成本低，对作物灰霉病的抗性风险评估及合理用药具有重要的理论指导意义。
【专利说明】一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株 的分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明是基于环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification， LAMP)对灰葡萄孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y菌株的快速分子鉴定方法，属于生物学领 域中分子生物学的检测方法。
【背景技术】
[0002] 灰霉病是一类由灰葡萄孢（Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害200 多种蔬菜、果树以及观赏性植物等重要的经济作物，该病的发生可引起植物幼苗、果实及贮 藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窑，造成严重的经济损失。近年来，随着保护地蔬菜生 产的发展，加重了灰霉病的发生和流行。目前由于作物种质资源缺少高抗灰霉病的品种，采 用化学药剂是控制灰霉病最有效方便的途径之一。多年来，灰霉病主要采用苯并咪唑类杀 菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行防治。但是随着使用年限的增长的使用剂量的增加， 田间逐渐产生了抗药性群体，从而导致该病防效显著下降。经过多年的研究，南京农业大学 杀菌剂生物学实验室发现灰葡萄孢菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由灰葡萄孢菌β-微 管蛋白基因（BC1G_00122)突变造成，该基因编码第198位或200位氨基酸密码子的突变 可引起灰葡萄孢菌对多菌灵抗药性的产生，其中198位氨基酸的突变可引起灰葡萄孢菌对 多菌灵表现高水平抗性，200位氨基酸的突变可导致灰葡萄孢菌对多菌灵表现中等水平抗 性。200位氨基酸突变基因型为TTC - TAC，即苯丙氨酸（Phe，F)-络氨酸（Tyr，Y)，简写 为 F200Y。
[0003] 传统的鉴定方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对 菌丝生长的抑制作用进行鉴别，该方法鉴定周期长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且 在病原菌培养过程中存在杂菌污染。近年来，随着病原抗性基因型的鉴定，PCR技术得到了 广泛的应用，该技术需要昂贵的试验仪器和繁琐的电泳过程，在鉴定过程中还需要接触大 量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患，并且鉴定时长达数小时。为了克服 这些缺点，一种基于环介导恒温扩增技术（LAMP)在灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性基因型的 鉴定上受到一定的关注。
[0004] 环介导恒温扩增反应（LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的 恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一 套（4种）特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应， 60?65 °C范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀 产生。羟基萘酚蓝（HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不 同的颜色，阴性（没有扩增出产物）时为紫色，阳性（有产物扩增）时为天蓝色。LAMP方 法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小 时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度 高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原突变基因型的快速鉴定。
[0005] 本发明在抗药性机制研究的基础上，基于LAMP技术能快速、准确鉴定灰葡萄孢菌 对多菌灵的抗性基因型F200Y。该鉴定方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大 大提高检测效率，对灰霉病的抗药性治理及抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经 检索目前国内外尚未有灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的LAMP快速分子鉴定的相 关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是对已有的灰葡萄孢菌对多菌灵抗性菌株的鉴定方法中存在费时、 费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种简便、快速、省时省力、灵敏度高、检测成本低的鉴 定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的分子检测方法。
[0007] 本发明所述的快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子生物 学方法，步骤是：
[0008] (1)在灰葡萄孢菌的β微管蛋白基因（BC1G_00122)上包括200位氨基酸的序列 设计LAMP引物，分别以敏感菌株及抗性基因型F200Y菌株的基因组DNA为模板，利用所述 的LAMP引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，其中：所述的LAMP引物分别是：
[0009] LAMP反应所用的外引物对：
[0010] F3 ：ATCGCCAAAGGTTTCCGATA
[0011] B3 ：AGGTGGTAACACCGGACAT
[0012] LAMP反应所用的内引物对（含错配碱基）：
[0013] FIP ：T @ GGTCTCGTCAGAGTTCTCAACCAGTTGTCGAGCCATATAACGCA
[0014] BIP ：TGCATGAGAACCTTGAAGCTCAGCGACGGCGGAAACCAAGTG
[0015] (2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3. 0 %琼脂糖凝胶电泳上分离，观 察扩增结果；
[0016] (3)鉴定是否为多菌灵抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；LAMP扩增产物显示天 蓝色，电泳图谱应为梯状条带，判定为抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；扩增产物为紫 色，电泳图谱无条带扩增，判定为非抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株。
[0017] 其中：
[0018] 步骤⑴所述的LAMP总体积优选为10 μ L :
[0019]
【权利要求】
1. 一种基于LAMP技术快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子检 测方法，步骤是： (1) 运用两对特异性引物对待测样品的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的两 对特异性引物的碱基序列分别是： LAMP反应所用的外引物对： F3：ATCGCCAAAGGTTTCCGATA B3：AGGTGGTAACACCGGACAT LAMP反应所用的内引物对： FIP：TgiGGTCTCGTCAGAGTTCTCAACCAGTTGTCGAGCCATATAACGCA BIP：TGCATGAGAACCTTGAAGCTCAGCGACGGCGGAAACCAAGTG (2) 对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.O%琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩 增结果； (3) 鉴定是否为多菌灵抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；LAMP扩增产物显示天蓝色， 电泳图谱应为梯状条带，判定为抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株；扩增产物为紫色，电泳 图谱无条带扩增，判定为非抗性基因型F200Y的灰葡萄孢菌株。
2. 根据权利要求1所述快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子检 测方法，其特征在于：步骤（1)所述的LAMP总体积优选为10μL: DNA聚合酶8UVL 0.25 μ? 10χThermoPol Buffer 1.0 μ? MgC^ 25mM 1.6 μ? dNTP IOmM 0.8 μ? FIP 40 μΜ 0.4 pL BIP 40 μΜ 0.4μ? F3 10 μΜ 0.4 μΕ Β3 10 μΜ 0.4μ? 甜菜碱8 M LOuL HNB 2.5 mM 0.8 μ? 基因组DNA 0.4μ? 无菌ddH2〇 2.55 μ?^。
3. 根据权利要求1所述快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的分子检 测方法，其特征在于：步骤（1)所述的LAMP反应参数优选为60°C45min，80°ClOmin。
【文档编号】C12Q1/04GK104313177SQ201410646783
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】段亚冰, 周明国, 杨莹, 张晓柯, 王建新 申请人:南京农业大学