一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，将受体菌C78-3与含有manA、crp、relA和asd缺失的自杀载体大肠杆菌供体菌结合，在野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3中分别引入突变ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA，引入这些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为χ0011；并对四种突变进行表型鉴定。本发明可以使野生型猪霍乱沙门氏菌成为许多外源抗原的安全，有效的疫苗载体；为各种猪病，尤其是猪的许多细菌病提供由基因调控提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌减毒载体，具有极大的市场应用性。
CGMCC NO.9968
20141114
【专利说明】一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏 菌载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种将野生型猪霍乱沙门氏菌毒力基因逐渐 缺失的构建方法。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌，其减毒后具有优先的侵袭能力，在体内生长缓 慢，能够有效地持续刺激机体产生强有力的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。另外， 沙门氏菌载体具有免疫佐剂作用，其LPS作为一种内在佐剂，可以刺激宿主细胞释放各种 细胞因子。因此，减毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活苗或者亚单位苗更 有效。基因工程方法致弱的鼠伤寒沙门氏菌已被用作基因载体广泛表达外源基因，用于肿 瘤、病毒病、细菌病、寄生虫病等的治疗研宄，并取得良好效果。但是在许多研宄报道中的 沙门氏菌载体，要么使减毒载体过度减毒，失去了免疫原性；或者保留了良好的免疫原性， 但是载体菌株却减毒不够，缺乏安全性而不能作为疫苗。因此迫切需要研制这样的一种疫 苗载体，既要使疫苗载体足够减毒，保证动物完全的安全，又要使疫苗载体和其携带的外源 抗原能够诱导出优秀的保护性抗体，抗击相关病原的感染。2008年，Curtiss R实验室首次 使用pmi缺失和araC Pbad激活启动子技术使鼠伤寒沙门氏菌延迟减毒，使得疫苗株在体外 培养时加入甘露糖和阿拉伯糖，接种小鼠时疫苗株没有减毒，而当细菌进入宿主体内，由于 动物机体内没有甘露糖和阿拉伯糖，随着细菌的复制，毒力基因 manA、crp、和relA就逐渐 不能被表达使细菌减毒，达到疫苗株具备野生型菌株定居宿主淋巴组织的能力；araC Pbad 对IacI基因表达的调控，可以提高外源基因的表达。另外为避免使用抗性基因质粒载体， 保证减毒沙门氏菌中携带外源基因的质粒载体在宿主体内的稳定性，各种技术都被尝试。 例如Red同源重组法和平衡-致死的细菌/载体系统法。其中平衡-致死的细菌/载体系 统法是删除了细菌的asd基因，强制性地使细菌的生长需要人为加入二氨基庚二酸（是细 菌细胞壁肽聚糖层的一种基本成分），同时在表达外源抗原质粒载体上加入野生型细菌的 asd基因。然后将asd+的质粒电转化到asd-的细菌载体上形成互补。但是以上都是关于 鼠或人伤寒沙门氏菌的研宄，以猪霍乱沙门氏菌为载体的研宄，尤其是将manA(该基因等 同于鼠伤寒的pmi基因）缺失和araC Pbad激活启动子技术应用于构建猪霍乱沙门氏菌减 毒，在国内外还未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏 菌载体的构建方法，通过manA、araC Pbad激活启动子技术调控猪霍乱沙门氏菌毒力基因逐 渐缺失，控制猪霍乱沙门氏菌毒力基因缺失的时机，使猪霍乱沙门氏菌在甘露糖和阿拉伯 糖的调控下毒力逐渐减弱的同时，外源抗原的表达得以不断提高，最终使减毒株能够像野 生型猪霍乱沙门氏菌那样高效率入侵宿主机体诱导优质的免疫原性后逐渐减毒，又能够高 效率地表达外源抗原，获得理想的针对猪霍乱沙门氏菌和外源抗原的免疫原性。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0005] -种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，包 括以下步骤：（1)选择作为构建X 0011株的野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3作为受体 菌；（2)构建基因、启动子缺失和插入araC Pbad结构的自杀载体，即AmanA，ΛΡ"ρ: :TT araC Pbad crp，ArelA::araC Pbad IacI TT和AasdA;(3)同源重组法将上一步的含有的基因或 启动子缺失的自杀载体引入野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3中，引入这些突变后的猪霍 乱沙门氏菌称为X0011 ; (4)对四种突变进行表型鉴定。
[0006] 本发明的猪霍乱沙门氏菌减毒突变株x〇011(AmanA，APrap: :TT araC Pbad crp， ArelA::araC Pbad IacI TT和AasdA)，由本发明的发明人保藏在位于中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏日为2014年11月 14日，保藏编号为CGMCC NO. 9968,该生物材料的分类命名为：猪霍乱沙门氏菌减毒株，拉 丁文学名为：Salmonella Choleraesuis0
[0007] 步骤⑷具体为：将猪链球菌II型菌株的6-PGD蛋白作为外源抗原插入原核表达 载体PYA3493中，构建成表达外源抗原6-P⑶的原核表达质粒pYA6-P⑶；将原核表达载体 PYA3493 或 pYA6-P⑶电转化至减毒株 X 0011，形成 X 0011 (pYA3493)或 X 0011 (pYA6-P⑶） 减毒株；测定中国商用猪霍乱沙门氏菌标准疫苗弱毒株C500、x〇011(pYA3493)或 X 0011 (PYA6-P⑶）减毒株和野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3的半数致死量，以及在BALB/c小 鼠体内的定居水平，评价x〇〇ll(pYA3493)或x〇011(pYA6-P⑶）减毒株的减毒能力。
[0008] 通过传代和PCR技术对X 0011 (pYA6-P⑶）减毒株携带外源抗原的质粒pYA6-P⑶ 在体内外传代的稳定性进行检测。
[0009] 使用BALB/c小鼠作为动物模型，猪链球菌II型野毒株作为攻毒株，评价 x〇011(pYA6-P⑶）减毒株的免疫效果。
[0010] 本发明的有益效果是：
[0011] 本发明以野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3为母本，采用自杀载体，在C78-3猪霍乱沙 门氏菌染色体上成功引入 AmanA，APrap: :TT araC Pbad crp，ArelA: :araC Pbad IacI TT和 AasdA四种基因改造，其中AmanA突变使沙门氏菌在不加甘露糖时manA基因不能表达而 减毒，而araC Pbad结构是由阿拉伯糖调控毒力基因 crp、relA和抑制原核表达载体pYA3493 启动子表达的IacI ;使经过基因改造的猪霍乱沙门氏菌C78-3在体外加入阿拉伯糖和甘露 糖时可以像野生菌一样正常生长和入侵动物机体，并具备像野生菌一样的免疫原性；而当 进入动物机体后，由于机体内缺乏阿拉伯糖和甘露糖，随着细菌的复制，外加的阿拉伯糖和 甘露糖的浓度渐渐减弱直至消失，菌株的毒力基因 manA，crp和IacI不能被表达，使猪霍 乱沙门氏菌C78-3的毒力减弱；而随着IacI蛋白表达的减少，IacI基因抑制原核表达载体 PYA3493的启动子的能力下降，从而使原核表达载体pYA3493表达外源抗原的能力逐渐提 高，即使有免疫原性的外源基因表达的浓度不断地上升，以获得通过调控基因的表达，一方 面使强毒株的毒力逐渐减弱，具备疫苗株良好的免疫原性和安全性的特性，另一方面可以 提高外源抗原的表达，使疫苗株具备良好的保护效率。动物实验结果证明，本发明中的减毒 株和现有弱毒疫苗株一样，它们的LD50比猪霍乱沙门氏菌强毒株要低10000倍，说明本发 明中的减毒株具有与现有弱毒疫苗株一样的的安全性；通过比较定居能力，本发明减毒株 在入侵宿主的肠道淋巴系统时比现有弱毒疫苗株强10-100倍的定居能力，并随着时间的 延续，这种效应更加明显，这表明本发明中减毒株具有诱导更加持久和优质免疫的基础；为 检测本发明减毒株的保护效率，我们以猪链球菌II型菌的6-PGD蛋白为对象，插入原核表 达载体PYA3493中，然后转化到减毒株xOOll中，成为x〇011(pYA6-Pffl))j^^BALB/(^J、 鼠的免疫发现，携带6-P⑶的xOOll可以100%抵抗野生型猪链球菌II型菌的攻击。
[0012] 本发明在猪霍乱沙门氏菌C78-3染色体上构建的AmanA，ΛΡ"ρ::ΤΤ araC Pbad crp，ArelA::araC Pbad IacI TT和AasdA四种基因缺失，可以使野生型猪霍乱沙门氏菌成 为许多外源抗原的安全，有效的疫苗载体；为各种猪病，尤其是猪的许多细菌病提供由基因 调控提高表达外源抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒载体，具有极大的市场应用性，能够创造出 显著的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 本发明的猪霍乱沙门氏菌减毒突变株x〇011(AmanA，ΛΡ"ρ::ΤΤ araC Pbad crp， ArelA::araC Pbad IacI TT和AasdA)，由本发明的发明人保藏在位于中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，保藏日为2014年11月 14日，保藏编号为CGMCC NO. 9968,该生物材料的分类命名为：猪霍乱沙门氏菌减毒株，拉 丁文学名为：Salmonella Choleraesuis0
[0014] 图1是ΔΡ"ρ: :TT araC P議crp基因缺失构建图；
[0015] 图 2 是 APcrp: :TT araC P議 crp 自杀载体图；
[0016] 图3是AmanA基因缺失构建图；
[0017] 图4是AmanA自杀载体图；
[0018] 图 5 是 ArelA: :araC Pbad IacI TT 基因缺失构建图；
[0019] 图 6 是 ΔrelA: :araC Pbad IacI TT 自杀载体图；
[0020] 图7是Δ asd基因缺失构建图；
[0021] 图8是Aasd自杀载体图；
[0022] 图9是ΔΡ"ρ: :TT araC Pbad crp缺失株阳性菌的PCR鉴定；
[0023] 图10是ΔΡ"ρ: :TT araC Pbad crp缺失株阳性菌的表型鉴定；
[0024] 图11是AmanA缺失株阳性菌的PCR鉴定；
[0025] 图12是Δ manA缺失株LPS表型鉴定；
[0026] 图13是ArelA: :araC Pbad IacI TT缺失株阳性菌的PCR鉴定；
[0027] 图 14 是 Western blot 鉴定 Δ relA: :araC Pbad IacI TT 的表型；
[0028] 图15是Δ asd缺失株阳性菌的PCR鉴定；
[0029] 图16是Aasd缺失株阳性菌的表型鉴定；
[0030] 图17是asd+的未插入外源基因抗原的质粒pYA3493和插入6-P⑶质粒pYA6-P⑶ 的结构图；
[0031] 图18是乂0011(?￥八6-?0))工78-3和0500在猪肺巨噬细胞中的存活能力比较图 ；
[0032] 图 19 是 X 0011 (pYA6-PGD)、X 0011 (pYA3493)和 C500 在 BALB/c 小鼠中定居能力 的比较图；
[0033] 图20是pYA6-P⑶质粒在X 0011 (pYA6-P⑶）中体外传代双酶切结果；
[0034] 图21是pYA6-P⑶质粒在x 0011 (pYA6-P⑶）中经口服BALB/c小鼠后不同时间段 的双酶切图；
[0035] 图22是动物保护效率实验图；
[0036] 图23是ELISA检测X 0011 (pYA6-P⑶）诱导的抗6-P⑶的IgG、IgA和抗沙门氏菌 LPS的IgG抗体图。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例子及附图对本发明做进一步说明。
[0038] 实施例1
[0039] 缺失manA、crp、relA和asd基因的自杀载体的构建
[0040] 1.缺失crp基因的自杀载体的构建
[0041] 在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的crp基 因及其上游序列，在crp基因和上游基因中设计同源臂序列引物，删除crp基因启动子区 的95个核苷酸，然后插入转录终止子（TT)和araC Pbad激活启动子序列1335bp，其删除和 插入的系统为crp基因上游yhfA部分序列、删除crp基因启动子区的95个核苷酸、1335bp 的转录终止子（TT)和araC Pbad激活启动子序列、删除95bp crp基因启动子后的crp序 列，全称为ΔΡ"ρ::ΤΤ araC Pbad crp(P表示启动子，TT表示转录终止子）（图1);具体步骤 是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物Pl和P2经PCR获得yhfA同源臂区，称为片段 I (330bp);由引物P3和P4经PCR获得删除crp基因启动子区的95个核苷酸后其余的crp 基因中356bp同源臂称为片段2 ;由引物P5和P6经PCR获得TT araCPBAD结构序列，称为 片段3 ;片段1与片段3经平端连接，连接产物转化至pGEM-T EasyVector克隆载体（商业 购买）；将其连接序列酶切后补平，与片段2平端连接，连接产物转化至pGEM-T EasyVector 克隆载体，产生ΔΡ"ρ::ΤΤ araC Pbad crp结构序列，将阳性质粒送至Takara公司测序，获得 正确的序列后，经SphI和SacI酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载 体PRE112中（图1，pRE112由美国Dr. Curtiss III惠赠），通过酶切鉴定和序列测定，将 正确的ΔΡ"ρ::ΤΤ araC Pbad crp结构自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌X 7213中，称为 X 7213 (pYAsOO 1)，保存在-20 °C冰箱中备用。
[0042] 构建APcrp: : TT araC Pbad crp自杀载体的引物：
[0043] Pl:5' -acatgcatgcATCTCCATCGGACTCGGCGCTTT-3'
[0044] P2:5-'catctgcagTTGTAGCCTGTAATGTGATGTCC-3'
[0045] P3:5'-ccgctcgagAGGATAACCGCGCATGGTGC-3'
[0046] P4:5'-tgcgagctcCAGAATATCCGGGTTGACCTG-3'
[0047] P5:
[0048] 5' -GCCCTGCAGAGATCT
[0049] CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGTGAATATATTATCACA ATTCTAGGATAGAATAATAAA-3'
[0050] P6:5'-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG-3'
[0051] 2.缺失manA基因的自杀载体的构建
[0052] 在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的manAS 因及其上下游序列，在上下游基因中设计引物，以上下游基因的300bp左右为同源臂，删除 manA基因，共计1176bp (图3);具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物Pl和 P2经PCR获得ydgA同源臂基因序列，称为片段I (333bp);由引物P3和P4经PCR获得fumA 基因的同源臂序列，称为片段2 (280bp);将片段1和片段2补平后进行平端连接，连接转化 至pGEM-T EasyVector克隆载体，提取阳性质粒，送至Takara公司进行序列测定；取正确 序列的AmanA结构经KpnI和SacI酶切，连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体 PRE112中（图4)，通过酶切鉴定和序列测定，将正确缺失manA基因序列的pRE112载体电 转化至工程菌大肠杆菌X 7213中，称为X 7213 (pYAs002)。将鉴定正确的含有AmanA突变 质粒的x7213(pYAs002)保存在-20°C冰箱中备用。
[0053] Pl:5'-GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3'
[0054] P2:5'-CGGCCAACACAGCGCCGCGATTC-3'
[0055] P3:5'-CCATACCGAGCGGTAAGTGAG-3'
[0056] P4:5'-GGGGGTACCTTCGGCGACGGAAACATGTTCGCT-3'
[0057] 3.构建ArelA: :araC Pbad IacI TT基因突变自杀载体
[0058] 在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的relA基 因及其上下游序列（上游包括SCH2895,下游是ygcA基因），在上下游基因中设计引物，以 上下游基因的300bp左右为同源臂，删除relA基因的2247bp，然后插入araC Pbad IacI TT 序列（图5)。具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物Pl和P2经PCR获得ygcA 同源臂区，称为片段1 ;由引物P3和P4经PCR获得relA2235前的SCH2895同源臂区，称为 片段2;由引物P5和P6经PCR获得araC Pbad IacI TT结构序列，称为片段3;片段IgBgl Π 酶切，片段2经Xbal酶切，片段3经Bgl II和Xbal双酶切；然后将片段1-3经连接酶 连接，形成ArelA: :araC Pbad IacI TT结构，将此连接产物转化至pGEM-T EasyVector克 隆载体，提取阳性质粒，送至Takara公司进行序列测定；取正确序列的ArelA: :araC Pbad IacI TT结构式经kpnl和SacI酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载 体PRE112中（图6)，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的ArelA: :araC Pbad IacI TT结构 式自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌X 7213中，称为X 7213 (pYAs003)，保存在-20°C冰箱 中备用。
[0059] Pl:5'-CCCAAGCTTGAGCTCGAGGGCGTTCCGGCGCTGGTAGAA-3'
[0060] P2:5'-GAAGATCTAAGGGACCAGGCCTACCGAAG-3'
[0061] P3:5'-CGGAATTCACCCCAGACAGTAATCATGTAGCGGCT-3'
[0062] P4:5'-CGGGTACCCCAGATATTTTCCAGATCTTCAC-3'
[0063] P5:
[0064] 5'-GCCCTGCAGAGATCTTTTATTATTCTATCCTAGAATTGTGATAATATATTCACAATTCTAGGAGTT GTAAACTGCTTTTATTTATCTAGAGGCCTAGGTACCAGG-3'
[0065] P6:5'-TGGTCTAGAGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCG-3'
[0066] 4.构建Aasd基因突变自杀载体
[0067] 在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的asd基 因及其上下游序列（上游包括glgB，下游是SCH3470和gntU基因），在上下游基因中设计 引物，以上下游基因各300bp左右为同源臂，删除asd基因的1104bp (图7)。具体步骤是 以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物Pl和P2经PCR获得SCH3470和gntU基因同源臂 区，称为片段l(340bp);由引物P3和P4经PCR获得asd基因前的glgB同源臂区，称为片段 2 (293bp);将片段1和片段2酶切补平后进行平端连接，连接转化至pGEM-T EasyVector克 隆载体，提取阳性质粒，送至Takara公司进行序列测定；取正确序列的Δ asd结构经XbaI 和XmaI酶切，连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体pREl 12中（图8)，通过酶切鉴 定和序列测定，将正确的Aasd结构式自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌X7213中，称为 X 7213 (pYAsO(M)，保存在-20 °C冰箱中备用。
[0068] Pl:5'P1:5-TGCTCTAGA TGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3'
[0069] P2 :5'P2:5-GCATGC catagcgtttttttcctgcaa-3'
[0070] P3 :5 P3:5-GAGCTC cgataagcgctgcaatagcca-3
[0071] P4 :5'P4:5-TCCCCCGGG TATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3'
[0072] 实施例2
[0073] 猪霍乱沙门氏菌减毒株xOO 11的构建和鉴定
[0074] l.C78_3(APerp::TT araC Pbad crp)突变株的构建和鉴定
[0075] I. lC78_3(APcrp: :TT araC Pbad crp)突变株的构建
[0076] 在ImLLB培养基中加入受体菌C78-3 (野生型猪霍乱沙门氏菌强毒），37°C培养过 夜；同时在含有5〇11^/1111的2,6-二氨基庚二酸（2,6-(1丨3111；[110口;[11161;^3(^(1，04?)，2511^/ ml的氯霉素（chloramphenicol，Cm)的ImLLB培养液中加入供体菌X 7213 (pYAsOOl) (ΛΡ"ρ::ΤΤ araC Pbad crp的自杀载体），37°C培养过夜，使受体菌和供体菌发生结合。
[0077] I. 2 APcrp: :TT araC Pbad crp 缺失株的筛选
[0078] 将结合的菌落在含氯霉素的LB固体培养板上划单菌落；取生长的单菌落在ImLLB 培养液中培养，37°C摇震培养至菌液浓度混浊；将菌液涂布于含5%蔗糖的LB固体培养板 上，继续培养2?3d至在5%蔗糖的LB固体培养板上长出菌落。1. 3C78-3 ( Λ manA Λ Prap: : TT araC Pbad crp)突变株的PCR鉴定
[0079] 将在5 %鹿糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板上和含氯霉素 的LB固体培养板上划线；将在LB固体培养板上生长，但是在含氯霉素的LB固体培养板上 不生长的菌落，
[0080] 用引物 Pl (PI: acatgcatgcATCTCCATCGGACTCGGCGCTTT-3')
[0081] 和 P4(5'-tgcgagctcCAGAATATCCGCGTTGACTTG-3')进行 PCR 鉴定，APcrp: :TT araC PBAD crp缺失株阳性菌的PCR片段大小为2024bp，阴性菌的PCR片段大小为 784bp (图 9,图中，M :为 DNA marker，DL2000 ;l-4:2024bp 为阳性结果；5 :为阴性对照）。
[0082] I. 5 APcrp: : TT araC Pbad crp 突变株的表型鉴定
[0083] 在含有阿拉伯糖和/或麦芽糖的麦康凯培养基上进行ΛΡ"ρ: :TT araC Pbad crp突 变株的表型鉴定。由于crp基因能够利用麦芽糖发酵，使C78-3在没有缺失crp基因时在 麦康凯上呈现红色菌落；当缺失crp基因时，菌落由于不能利用麦芽糖而使菌落呈现白色 (图10左图）；而当在加入阿拉伯糖的麦康凯培养基上，由于阿拉伯糖调控crp基因的启动 子能够进行工作，crp缺失株与野毒株C78-3 -样能够利用阿拉伯糖，使之在含有阿拉伯糖 的麦康凯上呈现红色（图10右左图，图中，A :加入麦芽糖的麦康凯培养基；左侧为野毒株 C78-3、右侧为C78-3(APrap::TT araC Pbad crp);B:加入麦芽糖和阿拉伯糖的麦康凯培养 基，左侧为野毒株〇78-3、右侧为〇78-3(八？_::17&四〇?_(：印)）。
[0084] 2. C78-3 ( Δ Perp: : TT araC Pbad crp) + Δ manA 突变株的构建和鉴定
[0085] 2. 1供体菌和受体菌的结合
[0086] 受体菌为 C78_3(APrap: :TT araC Pbad crp)突变株，供体菌为 x7213(pYAs002) (含AmanA自杀载体的大肠杆菌）。构建方法同实施1的1.1?1.2。2. 2 AmanA缺失株 阳性菌的PCR鉴定
[0087] 将在5 %鹿糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板上和含氯霉素 的LB固体培养板上划线；将在LB固体培养板上生长，但是在含氯霉素的LB固体培养板上 不生长的菌落，
[0088] 用引物 Pl (5' -GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3')
[0089] 和 P4 (5' -GGGGGTACCTTCGGCGACGGAAACATGTTCGCT-3')进行 PCR 鉴定，ΔmanA 缺 失株阳性菌的PCR片段大小为613bp，阴性菌的PCR片段大小为1783bp (图11，图中， M:DL2000 ;1-4:阳性结果（613bp) ;5 :阴性对照（1783bp))。
[0090] 2. 3 AmanA缺失株阳性菌的表型鉴定
[0091] manA基因缺失突变后，在6-磷酸果糖生成6-磷酸甘露糖的过程中缺少了磷酸甘 露糖异构酶，突变菌就不能合成LPS 〇-抗原的侧链，在LPS中〇-抗原就会变成光滑的条 带；但是在体外培养时，人工加入甘露糖后，具有AmanA突变的细菌可以合成LPS 〇-抗原 (见图12,图中，AmanA缺失株无甘露糖时失去〇抗原：A !AmanA缺失株；B :C500弱毒株； C :C78-3强毒株）。
[0092] 3. C78-3 ( Δ Pcrp: : TT araC Pbad crp Δ manA) + Δ relA: : araC Pbad IacI TT 突变株的 构建和鉴定
[0093] 3. 1C78-3 ( Δ Pcrp: : TT araC Pbad crp Δ manA) + Δ relA: : araC Pbad IacI TT 突变株 的构建
[0094] 受体菌为 C78_3( APerp: : TT araC Pbad crp AmanA)突变株，供体菌为 x7213(pYAs003)(含ArelA::araC Pbad IacI TT自杀载体的大肠杆菌）。构建方法同实 施1的I. 1?1. 2。
[0095] 3. 2C78-3 ( Δ Pcrp: : TT araC Pbad crp Δ manA) + Δ relA: : araC Pbad IacI TT 突变株 的PCR鉴定
[0096] 将5%鹿糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在LB固体培养板上和含氯霉素 的LB固体培养板上划线；将在LB固体培养板上生长，但在含氯霉素的LB固体培养板上不 生长的菌落，
[0097] 用引物 Pl (5' -CCCAAGCTTGAGCTCGAGGGCGTTCCGGCGCTGGTAGAA-3')
[0098] 和 P4 (5' -CGGGTACCCCAGATATTTTCCAGATCTTCAC-3')进行 PCR 鉴定，Δ relA: :araC Pbad IacI TT缺失株阳性菌的PCR片段大小为3307bp，阴性菌的PCR片段大小为3125bp (图 13,图中，M :DL1000 ;1-2 :阳性结果（3307bp))。
[0099] 3. 3C78-3 ( Δ Pcrp: : TT araC Pbad crp，Δ manA，Δ relA: : araC Pbad IacI TT)突变株 中 ArelA: :araC Pbad IacI TT 的表型鉴定
[0100] 在ArelA: :araC Pbad IacI TT突变的结构中，由阿拉伯糖控制IacI基因的表达。 即当有阿拉伯糖存在时，IacI基因被表达，表达的IacI蛋白就抑制沙门氏菌突变株携带的 原核表达载体表达外源蛋白；反之，当在没有阿拉伯糖存在的动物机体内，IacI基因不能 被表达，沙门氏菌突变株携带的原核表达载体就能更高效地表达外源蛋白。
[0101] 由于本实验需要突变菌株携带的外源蛋白的配合，因此我们使用了表达猪链球菌 II 型的外源蛋白 6-P ⑶的减毒株 X 0011 (PYA6-PGD) (APcrp: :TT araC PBAD crp，ArnanA， ArelA::araC PBAD IacI TT，AasdA)作为验证 ArelA::araC Pbad IacI TT表型的菌株。即 在培养突变株X 0011 (PYA6-P⑶）第一代时，加入0. 2 %阿拉伯糖和0. 2 %甘露糖；从第二代 培养开始，就不加阿拉伯糖和甘露糖，这样连续传代培养10代。随着传代代数的增加，细菌 中阿拉伯糖的含量逐渐减少，IacI基因的表达就完全被抑制，沙门氏菌突变株携带的原核 表达载体表达外源抗原6-P⑶蛋白表达量就逐渐增高，由Western blot的实验结果证明随 着传代代数的增加，6-P⑶蛋白表达量逐渐增高，见图14,图中，1?10: X 0011 (pYA6-P⑶） 在营养培养液中传的代次；6-PGD:53kD。
[0102] 4. C78-3 ( Δ manA Δ Pcrp: : TT araC Pbad crp Δ relA: : araC Pbad IacI TT) + Δ asd 突 变株的构建和鉴定
[0103] 4. 1C78-3 ( Δ manA Δ Pcrp: : TT araC Pbad crp Δ relA: : araC Pbad IacI TT) + Δ asd突 变株的构建
[0104] 受体菌为C78-3 ( Δ manA Δ Pcrp: : TT araC Pbad crpp Δ relA: : araC Pbad IacI TT)突 变株，供体菌为X 7213 (pYAs004)(含Λ asd自杀载体的大肠杆菌）。构建方法同实施1的 I. 1 ?1. 3〇
[0105] 4. 2C78-3 ( Δ manA Δ Pcrp: : TT araC Pbad crp Δ relA: : araC Pbad IacI TT) + Δ asd突 变株的Aasd PCR鉴定。
[0106] 将在5 %蔗糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别在含DAP的LB固体培养板 上和同时含DAP和氯霉素的LB固体培养板上划线；将在含DAP的LB固体培养板上生 长，但是在含DAP和氯霉素的LB固体培养板上不生长的菌落，用引物Pl (5'-TGCTCTAGA TGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3')和 P4 (5' -TCCCCCGGGTATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3')进行 PCR鉴 定，Λ asd缺失株阳性菌的PCR片段大小为633bp，阴性菌的PCR片段大小为1719bp (图15， 图中，M :DL10000;l-2: Aasd 基因阳性菌（633bp))。将 C78-3(A InanAAPcrp:: TT araC Pbad crpArelA::araC Pbad IacI TTAasd)突变株命名为 X0011 突变株。
[0107] 4. 3x0011突变株的表型鉴定
[0108] asd基因是二氨基庚二酸（DAP)生物合成途径中的必须酶，Aasd突变株在无外源 DAP 条件下溶菌死亡。C78_3(APcrp::TT araC Pbad crp，AmanA，ArelA: :araC Pbad IacI TT，AasdA)，即xOOll缺失株在含有外源DAP的LB中能生长，而在普通LB培养基中不能 生长，见图16, A : X 0011在不含DAP的LB中不生长；B : X 0011在含DAP的LB中生长。
[0109] 实施例3
[0110] 猪霍乱沙门氏菌减毒株X0011平衡-致死的细菌-载体系统的构建
[0111] 为避免使用耐药或含抗性基因的质粒载体，保证减毒沙门氏菌中的质粒载体 在宿主体内的稳定性，我们在猪霍乱沙门氏菌减毒株C78-3( Λ manA Λ Prap: : TT araC Pbad crpArelA::araC Pbad IacI TT)染色体上缺失了 asd基因，依据本实验室的命名顺序，将 此突变株命名为X 0011。当缺失asd基因的菌株在体外培养时可以通过加入二氨基庚二 酸（diaminopimelic acid，DAP)，弥补由于缺失asd基因后细菌不能生长的缺陷。但是由 于动物机体内没有二氨基庚二酸，缺失asd基因的沙门氏菌在动物体内就不能存活，因此， Dr. Curiss III实验室发明了在表达外源性抗原质粒载体上加入野生型细菌的asd基因， 即质粒pYA3493asd+，或者是插入猪链球菌II型的6-P⑶基因的质粒pYA6-P⑶（见图17)， 然后将asd+的原核表达载体质粒电转化到asd-的细菌载体上形成互补，使缺失asd基因 的沙门氏菌在动物体内可以存活的同时，避免使用耐药或抗性基因质粒载体。
[0112] 因此本实施首先将突变菌株 x〇011[C78-3(AmanAAPrap: :TT araC Pbad crpArelA::araC Pbad IacI TTAasd)]制作成感受态。具体步骤是：挑取单菌落xOOll 用含有50mg/ml DAP的2mL的LB培养液培养过夜；次日按1:100比例，将过夜培养的菌 液接种至20mL的LB培养液继续培养，振荡培养至OD 6tltl^ 0. 6 (3?4h)，冰浴lOmin，4°C、 1500rpm离心IOmin收集细菌，沉淀细菌用冰浴预冷的10 %甘油洗3遍，用25 μ 1预冷的 10%甘油重悬，即为XOOll的感受态细胞。获得XOOll的感受态细胞后，用氯化钙法，取 1 μ L的质粒pYA3493 (由Dr. Curiss III惠赠）或者pYA6-P⑶转化至X 0011的感受态细 胞中；将转化产物涂布于含有〇. 2%阿拉伯糖和0. 2%甘露糖的LB固体培养板上培养过夜 (不含DAP);取长出的单个菌落继续培养提取质粒（ρΥΑ3493或者ρΥΑ6-Ρ⑶），经EcoRI单 酶切，获得 3845bp条带的菌株即为携带质粒pYA3493 的x0011，称为x0011(pYA3493); 或者单酶切后获得454化？条带的菌株为携带？￥46-?0)的乂0011，成为乂0011(?￥46-?6); X 0011 (PYA3493)或X 0011 (pYA6-PG)能够在不加 DAP的培养条件或在没有DAP的动物体 内生长。
[0113] 实施例4
[0114] 猪霍乱沙门氏菌减毒株乂0011(?￥八6-?0))与野毒株078-3、弱毒疫苗株0500的毒 力比较
[0115] 1.减毒株半数致死量（LD50)的测定
[0116] 为测定猪霍乱沙门氏菌减毒株XOOll的毒力，取野毒株C78-3,中国现用猪霍乱 沙门氏菌弱毒疫苗株C500、表达6-P⑶的猪霍乱沙门氏菌减毒株X 0011 (pYA6-PGD)三株同 时进行菌株半数致死量（LD50)的测定。
[0117] 从_70°C超低温冰箱中取出实验菌株，无菌划线培养于LB固体培养平板上，37°C 静置培养过夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培养液中，37°C静置培养18h ;取其中的2. 5mL 置于47. 5mL的LB培养液中；用于培养突变株xOO 11 (pYA6-P⑶）的LB培养液加入0. 2 %的 阿拉伯糖和〇. 2 %甘露糖；等细菌浓度达到OD值为0. 8?0. 9时，取出菌株培养液，离心， 将细菌浓度调节到l〇1(lCFU/ml后，用PBS 10倍稀释到不同的稀释浓度。
[0118] 120只雌性6周龄BALB/c鼠随机分成12小组，每小组10只小鼠。4小组用于野 毒株078-3的0)50的测定，稀释度分别是10°，10'1(^和1(^ 3;4小组用于中国现用弱毒 疫苗株C500的LD50的测定，稀释度分别是1(Γ5,10Λ KT7和10Λ4小组用于猪霍乱沙门氏 菌减毒株X 0011 (PYA6-P⑶）的LD50的测定，稀释度分别是10_5,10_6,10_7和10 _8;每只小 鼠用IOOul细菌悬液腹腔注射，连续观察30日，计算小鼠的死亡数。实验结果显示野毒株 C78-3 的 LD50 是 2. 2 X IO2;弱毒疫苗株C500 的 LD50 是 2. 8 X 10 7;减毒株 X 0011 (pYA6-P⑶） 的LD50是L 4X IO7(见表1)。结果表明，减毒株的毒力比强毒株的毒力降低了 L 57X IO5 倍，与商用中国沙门氏菌弱毒疫苗株C500的毒力相似。证明猪霍乱沙门氏菌减毒株 X 0011(pYA6-P⑶）与中国现用弱毒疫苗株C500-样安全减毒。本实验共计做了 2次，结果 为2次试验的平均值。
[0119] 表 1 突变株 X 0011 (pYA6-P⑶）对 6 周龄 BALB/c 鼠的 LD50
[0120]
【权利要求】
1. 一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，其特 征在于：包括以下步骤：（1)选择作为构建X 0011株的野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3 作为受体菌；（2)构建基因、启动子缺失和插入araC PBAD结构的自杀载体，S卩AmanA， APcrp: :TT araC PBAD crp，ArelA: :araC PBAD lacl TT和 AasdA ; (3)同源重组法将上一步 的含有的基因或启动子缺失的自杀载体引入野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3中，引入这 些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为x 0011 ; (4)对四种突变进行表型鉴定。
2. 如权利要求1所述的基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体 的构建方法，其特征在于：步骤（4)具体为：将猪链球菌II型菌株的6-PGD蛋白作为外源抗 原插入原核表达载体PYA3493中，构建成表达外源抗原6-P⑶的原核表达质粒pYA6-P⑶； 将原核表达载体PYA3493或pYA6-P⑶电转化至减毒株x 0011，形成x 0011 (pYA3493) 或x〇〇ll(PYA6-P⑶）减毒株；测定中国商用猪霍乱沙门氏菌标准疫苗弱毒株C500、 x 0011 (pYA3493)或x 0011 (pYA6-P⑶）减毒株和野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3的半数致死 量，以及在BALB/c小鼠体内的定居水平，评价x〇〇ll(pYA3493)或x〇〇ll(pYA6-P⑶）减毒 株的逐渐减毒的能力和特性。
3. 如权利要求2所述的基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体 的构建方法，其特征在于：对x 0011 (pYA6-PGD)减毒株在体内外传代的稳定性通过传代和 PCR技术进行检测。
4. 如权利要求2所述的基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体 的构建方法，其特征在于：使用BALB/c小鼠作为动物模型，猪链球菌II型野毒株作为攻毒 株，评价减毒疫苗株的免疫效果。
【文档编号】C12N15/74GK104498418SQ201410647735
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】石火英, 吉贞颖, 尚竞, 李玉安 申请人:扬州大学