一种重组表达葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组表达葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其应用，属于生物【技术领域】。本发明通过构建重组质粒pINA1297-GOD，醋酸锂转化法转化解脂耶氏酵母po1h，筛选获得了具有较好产酶能力的重组菌株。该菌株在以蔗糖为唯一碳源，发酵168h后，葡萄糖氧化酶酶活力达到13.9U/ml，与原黑曲霉相比，提高了两倍。
【专利说明】-种重组表达葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组表达葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶佑Iucose Oxidase,简称G0D，E. C. 1. 1. 3. 4)是一种黄素糖蛋白，在 有氧条件下能专一性地催化目-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氨。GOD广泛分布于动植物 和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为 黑曲霉和青霉。目前GOD的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。目前GOD的 应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。目前GOD基因已经在毕赤酵母GS115、大 肠杆菌、瑞氏木霉等中得到表达，但还未见其在非常规酵母解脂耶氏酵母中进行表达研究， 而解脂耶氏酵母被认为是安全的，因此，能用于食品和药物生产上。
[000引解脂耶氏酵母化Id菌系中，编码能水解其它蛋白质的AEP基因被剔除，使得外源 蛋白能更好地表达。人们将化Id系改造，生成一系列的派生菌系，如化化、Polg、化If。 Po化、化Ig在化Id系基础上进行改造，只有一个营养缺陷型基因。化Ig被改造为适合W 地R322为基础的质粒整合的菌系，化化将穿梭质粒的细菌部分在整合入酵母前剔除掉，形 成酵母框。它们均在化Id系的基础上均被剔除了酸性蛋白酶基因，消除了全部蛋白酶活 性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株能够高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母重组菌株，是W PINA1297为载体表达编码葡萄糖氧化酶的基因。
[0005] 所述葡萄糖氧化酶基因来源黑曲霉Aspergillus niger CCTCC NO ;M2011291，其 核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 所述解脂耶氏酵母重组菌是W解脂耶氏酵母化比为出发菌株。
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述解脂耶氏酵母重组菌株的 方法，主要包括W下步骤；（1)构建重组表达载体PINA1297-G0D ; (2)醋酸裡法转化解脂耶 氏酵母POlh ; (3)重组菌株的筛选；（4)重组菌株的验证。
[0008] 本发明要解决的第H个技术问题是提供一种应用所述解脂耶氏酵母重组菌株发 酵产葡萄糖氧化酶的方法，是将重组菌接种到种子液体培养基YTO中，培养2化后W 10 %的 接种量转接至发酵培养基PPB中，于28C、200r/min摇床中培养16她。
[0009] 本发明所得解脂耶氏酵母重组菌可利用藏糖等廉价的作碳源，适合高密度发酵。 且解脂耶氏酵母被认为是安全的，适用于食品、SCP等的工业化生产。此外，解脂耶氏酵母表 达体系选用营养缺陷型作为重组菌的筛选标记，也避免了抗生素危险人体健康的风险。因 而利用该酵母可构建食品安全级产葡萄糖氧化酶菌株。
【具体实施方式】
[0010] 主要试剂；蛋白腺和酵母粉购自OXIOD公司；E. COli感受态试剂盒、Primer star DNA聚合酶、胶回收试剂盒、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA突变试剂盒均购自TaKaRa公司 (大连）；质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；酵母基因组提取试剂盒购自天 根生化科技（北京）有限公司；SDS-PAGE试剂盒和蛋白质标准分子量购于碧云天生物技术 研究所（南通）；其他试剂均为国产分析纯。
[0011] 所需培养基；Yro培养基（g/L);葡萄糖20;蛋白腺20;酵母粉10。YNB培养基 (g/L);葡萄糖20 ;YNB1. 7 ;硫酸馈5。PPB培养基（g/L);藏糖20 ;酵母提取物1. 32 ;氯化 馈1. 32 ;磯酸二氨钟0. 32 ;无水硫酸镇0. 132 ;维生素B13. 34X10-4 ;溶于巧樣酸盐缓冲液 P册.0中。固体培养基在此基础上添加2 %琼脂粉。
[0012] Y. Iipolytica种子培养条件：从-8(TC保藏的工程菌甘油管点至YTO固体培养基， 28C培养过夜，用接种针挑取单菌落接种于用250mL H角瓶装有25mL的Yro液体培养基 中，于28°C培养18?2化，转速为200巧m。
[0013] Y. Iipolytica发酵培养条件：采用PPB培养基，培养基用250血H角瓶装液25血， 接种量为10%，于28C培养，转速为200巧m，培养至发酵结束。
[0014] 酶活测定方法：
[0015] 酶活力单位定义：在30°C, P册.0的条件下，Imin从1 Ji mol的目-D-葡萄糖氧化 成D-葡萄糖酸和&化所需的酶量为一个葡萄糖氧化酶酶活力单位，W U/mL表示。
[0016] 试管中加入2. 5血邻联茵香胺溶液，0. 3血的18%葡萄糖，0. 1血的lOOU/ml辣根 过氧化物酶，30°C保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0. ImU反应3min后，加入 2mol/L硫酸终止反应。取出试管，测0D500的吸光值，W热失活的酶液做空白对照。
[0017] 结果表示与计算：
[001 引 X = [ A A今（7. 5XtX0. 1)] XSXn
[0019] 式中：
[0020] A A- 500nm 吸光值
[002U t-测定时间，min
[0022] 0.1-样品体积，ml
[002引 5-终反应体积，ml
[0024] 7. 5-消光系数
[00幼 n-稀释倍数
[0026] 实施例 1 质粒 PINA1297-G0D，PINA1296-G0D 的构建。
[0027] 分别W pINA1297、pINA1296作为合成葡萄糖氧化酶外源基因的表达载体。
[002引通过PCR用引物Al和A2从黑曲霉Aspergillus niger基因组获得基因内Sfil 位点突变的葡萄糖氧化酶基因片段，转化大肠杆菌JM109。通过PCR用引物Bl和B2从大 肠杆菌JM109基因组克隆得到带有Sfi I和BamH I酶切位点的葡萄糖氧化酶基因片段。 PCR产物和表达载体分别用相应的限制性内切酶酶切W后，连接转化，筛选得到重组质粒 PINA1297-G0D。通过PCR用引物Cl和C2从大肠杆菌JM109基因组克隆得到带有化ndIII 和化nl酶切位点的葡萄糖氧化酶基因片段。PCR产物和表达载体分别用相应的限制性内切 酶酶切W后，连接转化，筛选得到重组质粒PINA1296-G0D。
[0029] 实施例2葡萄糖氧化酶生产菌的构建。
[0030] 将Not I线性化的重组质粒pINA1297-G0D、pINA1296-G0D用醋酸裡转化法导入解 脂耶氏酵母中。
[0031] 由于质粒pINA1296( W地R322为基础的单拷贝整合质粒）和质粒pINA1297(含 zeta位点的多拷贝整合质粒）的不同选择性标记及整合机制，将经NotI线性化的重 组表达载体 PINA1297-G0D 和 PINA1296-G0D 分别转化至 Y. Lipolytica Polh (化a-) 菌株和Y. Lipolytica化lg(Leu-，含地R322整合平台）中，利用缺陷型的YNB平 板进行阳性转化子的筛选，经菌落PCR验证，成功筛选出阳性单菌落，得到重组菌 Y. lipol5Ttica(pINA1297-GOD)及 Y. lipol5Ttica(pINA1296-GOD)。经 NotI 线性化之后， PINA1297-G0D含细菌部分的Kan抗性基因已被去除。
[0032] 实施例3重组菌株摇瓶发酵生产葡萄糖氧化酶。
[0033] 重组菌在YTO平板上活化培养一定阶段，接种到种子液体培养基YPD中，2化后W 10%的接种量转接至发酵培养基PPB中，于28C、200r/min摇床中培养，测定发酵上清液的 葡萄糖氧化酶活力。比较不同转化子的发酵液酶活力，Y. lip〇lytica(pINA1297-G0D)培养 16她后的发酵液上清葡萄糖氧化酶活力达到13. 9U/ml，是Y. lipol5Ttica(pINA1296-GOD) 的9倍。与原黑曲霉产酶能力4.抓/ml相比，提高了两倍。
[0034] 虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一株能够高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母重组菌，其特征在于，是以解脂耶氏酵 母Polh为宿主，以PINA1297为载体表达编码葡萄糖氧化酶的基因。
2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因来源黑曲霉 Aspergillus niger CCTCC NO ：M2011291〇
3. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
4. 一种构建权利要求1所述解脂耶氏酵母重组菌的方法，其特征在于，主要包括以下 步骤：（1)构建重组表达载体PINA1297-G0D ; (2)醋酸锂法转化解脂耶氏酵母Polh ; (3)筛 选验证重组菌株。
5. 权利要求1所述解脂耶氏酵母重组菌在葡萄糖氧化酶生产中的应用方法。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，是将重组菌接种到种子液体培养基YPD 中，培养24h后以10%的接种量转接至发酵培养基PPB中，于28°C、200r/min摇床中培养 168h。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述YH)培养基按g/L计含有：葡萄糖20 ; 蛋白胨20;酵母粉10。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PPB培养基按g/L计含有：蔗糖20， 酵母提取物1. 32,氯化铵1. 32,磷酸二氢钾0. 32,无水硫酸镁0. 132,维生素& 3. 34 X 10_4 ; 溶于pH 6. 0的柠檬酸盐缓冲液中。
【文档编号】C12R1/645GK104357343SQ201410653076
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】陈坚, 刘晓筱, 张娟, 堵国成, 顾磊 申请人:江南大学