一种黄热病毒的微流体基因芯片检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速、灵敏的黄热病毒微流体基因芯片检测方法。本发明的检测方法整合了逆转录聚合酶链式反应RT-PCR和微阵列Microarray这两种强大的分子生物学技术，将RT-PCR与微阵列芯片杂交反应腔整合到一张芯片上，PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中。检测方法包括如下步骤：样本处理，RNA核酸提取，RT-PCR扩增反应，杂交，清洗，结果判定。通过本发明可大幅度提高出入境口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止重大虫媒传染病的输入。
【专利说明】一种黄热病毒的微流体基因芯片检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断试剂【技术领域】，具体涉及一种黄热病毒的微流体基因芯片检 测方法。
[0002] 背景介绍
[0003] 随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和 国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。近年来，新发 病毒性传染病在世界各国频频暴发流行，对人类健康带来严重威胁，给社会造成巨大经济 损失。这些新发病毒性传染病的频发给我们敲响了警钟，加强对其的研宄和监测以及早预 防控制是至关重要的。
[0004] 虫媒病毒是一类通过吸血节肢动物叮咬敏感脊椎动物宿主而在人畜之间进行传 播的病毒，其中100多种可以导致人畜疾病，严重者会导致死亡。黄热病毒属于虫媒病毒，B 组，为RNA病毒、呈球形、长约20?60纳米。在一70°C下保存10年仍有活力，在室温下容 易灭活，(TC下经48小时失去活性。主要由库蚊和伊蚊传播。虽未在我国出现，但是库蚊和 伊蚊在我国分布广泛，为其传入提供了方便。黄热病毒引起的急性传染病黄热病，主要流行 于非洲和中、南美洲，3-4月份的病例较多。黄热病是黄热病毒引起的急性传染病。临床以 发热、黄疽、蛋白尿、相对缓脉和出血等为特征。1907年黄热病被《国际卫生公约》列为国际 检疫传染病。近十年来，在非洲和拉丁美洲的十几个国家先后发生了数次黄热病散发流行， 而在我国尚无发病。对这些病原的快速检测技术的研宄目前尚属空白。随着我国商贸、旅 游业的快速发展，境内外人员交往日益密切，以及动物的进口等影响，黄热病毒输入的危 险性日益增高。因此，尽快建立快速简便、特异敏感的检测方法对防范黄热病毒的输入具 有重要意义。
[0005] 基因芯片采用微加工和微电子技术将大量的人工设计好的基因片段有序地、高密 度地排列在纤维膜等载体上。基因芯片可以同时固定大量的探针分子，可以在一次实验中 检出多种病原体；同时检测的灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在病原体分析检测 中有很好的应用前景。
[0006] 本发明整合了逆转录聚合酶链式反应RT-PCR和微阵列Microarray这两种强大的 分子生物学技术，将RT-PCR与微阵列芯片杂交反应腔整合到一张芯片上，PCR杂交的探针 直接固定在微阵列中的杂交舱中。操作简单，节省时间，灵敏度高，特异性好。为黄热病毒 的检测提供了快速，简便，灵敏的微流体基因芯片检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的黄热病毒微流体基因芯片检 测方法。通过本发明可大幅度提高进出口 口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工 作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止 外来输入性传染病的发生。
[0008] 本发明所提供的黄热病毒微流体基因芯片检测方法，包括如下检测步骤：
[0009] (1)样本混匀处理；
[0010] (2) RNA 核酸提取；
[0011] (3) RT-PCR 扩增反应：
[0012] a. RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液，特异性正、反向引物混合液，逆转录酶/ DNA聚合酶，DEPC水，RT-PCR质控品，样本RNA核酸；
[0013] b.将RT-PCR反应液加入已固化特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行 扩增反应；
[0014] 所述的特异性引物和探针是根据YFVgpl基因特异性引物扩增区内设计，能够区 别其他病毒株，特异性引物和探针为：
[0015] YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ ID NO 1)
[0016] YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ ID NO 2)
[0017] YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ ID NO 3)
[0018] (4)杂交：RT-PCR扩增完后，加入杂交反应液，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱 内进行杂交反应；
[0019] (5)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
[0020] (6)结果判定：根据杂交结果，判定感染情况。
[0021] 步骤（2)中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取试剂盒提取。取HOul血液样本， 裂解后，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
[0022] 步骤（3)中所述的RT-PCR反应体系为：2X RT-PCR反应液12. 5ul，引物混合液 2.5111，1411111%5042.5111，？0?6四(16!120 1111，逆转录酶/1)嫩聚合酶1111，？0?质控2111，样 本 3. 5ul。
[0023] 步骤（3)中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：50°C逆转录20min ;95°C预变性 2!1^11;95°0变性1〇8,60°0退火4〇8,72°0延伸5〇8;11个循环，每个循环退火温度降低1°〇， 直至退火温度变成50°0。95°0变性158,56°0退火4〇8,72°0延伸5〇8,40个循环。
[0024] 步骤（4)中所述的杂交反应条件是：95°C预变性3min ;58°C杂交30min。
[0025] 步骤（5)中所述的清洗条件是3000rpm，离心2min。
[0026] 步骤（3)所述的PCR扩增与步骤（4)所述的杂交在芯片仪上完成。
[0027] 本发明与现有检测方法相比，将RT-PCR的扩增过程和分子杂交检测过程浓缩到 一张基因芯片上检测，整个检测在3个小时内完成，大大缩减了检测的时间和复杂性，检测 设备简单也易于携带。本发明的检测方法简单快速，灵敏度高，特异性好，为黄热病毒的检 测提供了快速，简便，灵敏的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1实施例1黄热病毒阳性样本微流体基因芯片检测结果。
[0029] 本实施例中测检测结果显示本样本在黄热病毒属和黄热病毒毒株均显示为阳性。
[0030] 图2实施例1阴性对照样本微流体基因芯片检测结果。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0032] 实施例1黄热病毒样本微流体基因芯片检测
[0033] -、实验步骤
[0034] 1.样本准备
[0035] 本实施例中，阳性样本为减毒的黄热病毒17D毒株，阴性对照样本为健康人的血 液。
[0036] 2. RNA 的提取
[0037] 使用病毒RNA提取试剂盒（离心柱型）提取样本RNA。取HOul样本，按照试剂盒 说明书中的操作步骤提取RNA，最后用60ul洗脱液洗脱RNA。
[0038] 3.靶基因的扩增
[0039] 3.1引物和探针的设计
[0040] 根据YFVgpl基因设计的特异性引物和探针为：
[0041] YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ ID NO 1)
[0042] YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ ID NO 2)
[0043] YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ ID NO 3)
[0044] 特异性探针按照实验设计方案，分别点入芯片上各自孔中。
[0045] 3. 2RT-PCR 反应平台
[0046] 在温度控制仪上进行RT-PCR扩增与杂交反应。为防止引物间的互相干扰，RT-PCR 反应同时在两个反应室中进行，两个反应室都可以联通到杂交室，RT-PCR后的扩增液可以 通过注射推送方式使其流入杂交室进行杂交反应。
[0047] RT-PCR反应体系为：2X RT-PCR反应液12. 5ul，引物混合液2. 5ul，14mM MgS042.5ul，PCR Grade H20 lul,逆转录酶/DNA 聚合酶 lul，PCR 质控 2ul,样本 3.5ul。
[0048] 反应条件为：50°C逆转录20min ;95°C预变性2min ;95°C变性10s，60°C退火40s， 72°C延伸50s ; 11个循环，每个循环退火温度降低1°C，直至退火温度变成50°C。95°C变性 15s，56°C 退火 40s，72°C延伸 50s，40 个循环。
[0049] 4.杂交反应
[0050] 分别向两个RT-PCR反应室中加入14. 5ul杂交液，使杂交液和扩增液都进入到杂 交反应舱内。杂交反应条件是95°C预变性3min，58°C杂交30min。杂交后的芯片用洗液离 心（3000rpm，2min)洗绦，在芯片扫描仪上进行信号检测。
[0051] 二、实验结果
[0052] 从图1和图2的检测信号图来看，RT-PCR质控点信号正常，阴性对照点信号正常， 杂交对照点信号正常，说明从RT-PCR到杂交的整个反应过程均正常，从而说明整个反应有 效。根据每个点的荧光信号值（详见表1和表2)，对照整个反应舱的探针设计，阳性样本 在黄热病毒探针位置有明显的杂交信号，而在阴性对照样本的相应黄热病毒探针位置处未 发现有杂交信号。通过软件分析，判定样本为黄热病毒感染阳性，而阴性对照样本判定为阴 性。跟预期的样本感染情况一致。这表明本发明的微流体基因芯片的检测性能良好，能准 确地区分阴性及阳性样本，特异性良好，没有出现错判现象。
[0053] 表1阳性样本的检测信号数值
[0054]
【权利要求】
1. 一种黄热病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：包括如下检测步骤： (1) 样本混匀处理； (2) RNA核酸提取； (3) RT-PCR扩增反应： a. RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液，特异性正、反向引物混合液，逆转录酶/DNA 聚合酶，DEPC水，RT-PCR质控品，样本RNA核酸； b. 将RT-PCR反应液加入已固化特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩增 反应； 所述的特异性引物和探针是根据YFVgpl基因特异性引物扩增区内设计，能够区别其 他病毒株，特异性引物和探针为： YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ ID NO 1) YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ ID NO 2) YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ ID NO 3) (4) 杂交：RT-PCR扩增完后，加入杂交反应液，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内进 行杂交反应； (5) 清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测； (6) 结果判定：根据杂交结果，判定感染情况。
2. 根据权利要求1所述的黄热病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤（2) 中所述的RNA提取使用病毒RNA提取试剂盒提取；所述的RNA提取步骤为：取140ul血液 样本，裂解后，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
3. 根据权利要求1所述的黄热病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤（3) 中所述的PCR反应体系为：2X RT-PCR反应液12. 5ul，引物混合液2. 5ul，14mM MgS042. 5ul， PCR Grade H20 lul,逆转录酶/DNA 聚合酶 lul，PCR Control 2ul, Sample 3. 5ul〇
4. 根据权利要求1所述的黄热病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤（3) 中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：50°C逆转录20min ;95°C预变性2min ;95°C变性10s， 60°C退火40s，72°C延伸50s ; 11个循环，每个循环退火温度降低1°C，直至退火温度变成 50°〇；951：变性158,561：退火4〇8,721：延伸5〇8,40个循环。
5. 根据权利要求1所述的黄热病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤（4) 中所述的杂交反应条件是：95°C预变性3min ;58°C杂交30min。
6. 根据权利要求1所述的黄热病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤（5) 中所述的清洗条件是3000rpm，离心2min。
7. 根据权利要求1所述的黄热病毒的微流体基因芯片检测方法，其特征在于：步骤（3) 所述的PCR扩增与步骤（4)所述的杂交在芯片仪上完成。
【文档编号】C12Q1/68GK104498621SQ201410654941
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】田桢干, 李深伟, 张子龙, 周璇, 章琪, 李平 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局