一种samhd1基因敲除细胞系的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法，首先针对SAMHD1基因CDS1和CDS2共设计4对识别序列；然后将靶点识别单元模块的基因片段分别按照4对识别序列进行串联，并克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)-Destination质粒，构建4对TALEN表达质粒对；将4对TALEN质粒对分别转染293T细胞，并用新霉素筛选出敲除SAMHD1基因的细胞系；所述方法能够在基因组SAMHD1靶位点造成移码突变，形成目标基因敲除突变体，达到从基因组中稳定敲除SAMHD1基因的目的。
【专利说明】-种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及一种从基因组中敲除SAMHD1基因的方法， 可用于SAMHD1功能研究及构建SAMHD1表达稳定缺失的细胞系。
【背景技术】
[0002] 最近，Laguette N等在HIV-1难以感染的髓系细胞中发现了一种HIV-1的宿主 限制因子--SAMHD1，该分子可以水解dNTPs，从而抑制人类髓系细胞中HIV-1的复制。 SAMHD1全长67020bp，包含16个外显子，蛋白由626个氨基酸组成。Goldstone等测定了 它的结构和催化活性，晶体结构揭示SAMHD1是一个二聚体，其分子结构包括N-末端的SAM 结构域，HD结构域和C末端区域。HD结构域以组氨酸/天冬氨酸残基双联体基序为特征， 在进化上高度保守，在核酸代谢和信号传导等方面发挥重要作用。当SAM结构域缺失时，HD 结构域可以表现完全磷酸水解酶的功能。
[0003] SAMHD1是一种dGTP依赖的磷酸水解酶。SAMHD1先形成二聚体结构的分子，再结 合dGTP，并发生变构，从而暴露出磷酸水解酶的活性。它的主要功能是将dNTPs水解成脱氧 核苷和无机的三磷酸，从而降低核内dNTPs的浓度，参与细胞内的dNTPs代谢过程。SAMHD1 功能的缺失可以造成细胞内dNTPs的大量积聚，从而导致强烈的免疫活化和大量的I型干 扰素分泌。先天性的SAMHD1基因突变可以引起一种罕见的遗传性自身免疫性疾病--AGS (Aicardi-GoutiSres syndrome),这是一种类似于先天性宫内病毒感染表现的先天性脑 病，可以引起严重的脑萎缩和慢性脑脊液淋巴细胞增多，患者常伴有不适宜的免疫活化和 IFN-a的大量产生。SAMHD1基因缺陷的AGS患者的单核细胞更容易感染HIV-1，进一步在 人体原代细胞上验证了 SAMHD1的HIV-1感染限制功能。
[0004] 鉴于SAMHD1在细胞核酸代谢和HIV-1感染中的重要作用，敲除SAMHD1蛋白在 SAMHD1的功能研究中是十分重要的手段。目前敲除或降低SAMHD1表达的方法仅限于RNAi， 该方法仅能瞬时降低SAMHD1蛋白的表达，不能形成稳定敲除，更难以建立SAMHD1表达缺 失的细胞系，而且降低的程度也有限，不能完全敲除SAMHD1的表达。因此，有必要开发一种 从基因组中完全敲除 SAMHD1 基因的方法。TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的中文名为转录激活因子样效应物核酸酶，是基因组编辑核酸酶三 大类之一。它是实现基因敲除、敲入或转录激活等靶向基因组编辑的里程碑。相比于传统 的锌指核酸酶（ZFNs)技术，TALENs具有独特的优势：设计更简单，特异性更高，现在成为了 科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。是目前较有发展前景的基因 修饰技术。我们以TALENs技术为基础，开发了一种从基因组中完全敲除SAMHD1基因的方 法。该方法将为研究SAMHD1功能、建立SAMHD1缺失的细胞系以及HIV-1感染机制研究打 下基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对目前瞬时敲除SAMHD1方法的不稳定性和不彻底性，提供一 种从基因组中稳定敲除SAMHD1基因的方法，该方法除用于SAMHD1功能研究外，还可以用于 建立SAMHD1表达缺失细胞系，为其它研究提供细胞模型。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：一种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法， 包括以下步骤： (1) 针对SAMHD1基因的⑶S1选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L1/R1、L2/ R2 ;针对SAMHD1基因的⑶S2选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L3/R3、L4/R4 ; L1 ?L4 的序列如 SEQ ID N0. 17?SEQ ID N0. 20 所示，R1 ?R4 的序列如 SEQ ID N0. 21 ?SEQ ID NO. 24 所示；Ll/Rl、L2/R2、L3/R3、L4/R4 具体为：
【权利要求】
1. 一种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 针对SAMHD1基因的⑶S1选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为Ll/Rl、L2/ R2 ;针对SAMHD1基因的⑶S2选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L3/R3、L4/R4 ; L1 ?L4 的序列如 SEQ ID NO. 17?SEQ ID NO. 20 所示，R1 ?R4 的序列如 SEQ ID NO. 21 ?SEQ ID NO. 24所示； (2) 将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L1/R1、L2/R2、L3/R3、L4/R4序列进行串 联，串联成功后克隆入PCAG-T7-TALEN (Sangamo) - Destination质粒，共构建4对TALEN表 达质粒对；其中，靶点识别单元模块的基因片段按照L1序列进行串联后对应的氨基酸序列 如SEQ ID NO. 9所示；按照R1序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；按 照L2序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示；按照R2序列进行串联后对 应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；按照L3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；按照R3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示；按照L4 序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；按照R4序列进行串联后对应的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示； (3) 将构建好的4对TALEN表达质粒对分别用脂质体转染试剂盒转染到表达SAMHD1 的293T细胞系中，48小时后将细胞在含有浓度为100ug/ml的新霉素的DMEM培养基中培养 10-14天，筛选出活细胞，得到敲除SAMHD1基因的细胞系。
【文档编号】C12N15/85GK104450784SQ201410654987
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】靳昌忠, 吴南屏 申请人:浙江大学