一种扁座壳孢菌的规模化生产发酵培养基及发酵培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种扁座壳孢菌规模化生产发酵的廉价培养基，它由以下成分组成：花生饼粉15-25％，葡萄糖0.05-0.2％，胰蛋白胨0.05-0.2％，水为余量。本发明还公开了一种扁座壳孢菌发酵培养方法，该方法采用的三株高致病力和高产孢能力的扁座壳孢菌(Aschersonia placenta)菌株YW3、WD3、ZJ5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCC NO:M2013448、CCTCC NO:M2013447、CCTCC NO:M2013446。本发明所提供的发酵培养方法得到的是一种高致病力和高含量的扁座壳孢菌，对于粉虱类害虫的防治具有较好的应用前景。
CCTCC NO:M2013447
20130926
CCTCC NO:M2013446
20130926
CCTCC NO: M2013448
20130926
【专利说明】一种扁座壳孢菌的规模化生产发酵培养基及发酵培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种扁座壳孢菌（Aschersonia placenta)的规模化生产发酵培养基 和规模化生产发酵培养方法。
【背景技术】
[0002] 扁座壳孢菌是粉虱类害虫重要病原真菌，具有对粉虱类害虫强致病力，对人、畜和 植物无毒害，不杀伤天敌，不污染环境等特点，是目前国内外研宄应用较多的害虫生物防治 病原真菌，并成功用于茶园果园粉虱类、介壳虫类害虫的生物防治。调查研宄显示，扁座壳 孢菌能在粉虱种群中形成流行病，具有自然控制作用，近年来该菌在我国南方部分柑橘产 区的粉虱上寄生率为30% -50%，有的高达90%以上。
[0003] 作为重要的生物防治因子，很多研宄利用扁座壳孢菌发酵产物进行生物防治，但 是由于目前扁座壳孢菌发酵培养基成本高、发酵周期长，一般需28天才能达到最高产孢 量，相对于应用广泛的生防真菌白僵菌14-15天的发酵周期，扁座壳孢菌产孢效率较低，成 本高，对其投入生产应用造成障碍。所以，研发新的扁座壳孢菌发酵培养基及发酵培养方 法，对缩短生产周期，提高产孢效率具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种发酵周期短，产孢量大的扁座壳孢菌规 模化生产的发酵培养基和发酵培养方法。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] -种扁座壳孢菌规模化生产发酵培养基，它由以下重量百分比的成分组成：花生 饼粉15-25 %，葡萄糖0. 05-0. 2 %，胰蛋白胨0. 05-0. 2 %，水为余量。
[0007] 优选地，所述成分的重量百分比是：花生饼粉20%，葡萄糖0. 1%，胰蛋白胨 0. 1%，水为余量。
[0008] -种高致病力扁座壳孢菌规模化生产发酵培养方法，该方法是：首先从柑橘粉虱 虫尸上筛选分离出三株高致病力和高产孢能力的扁座壳孢菌（Aschersonia placenta)菌 株，然后将该三株菌株中的一种接种于PDA培养基上，置于25±1°C恒温培养箱中培养2-4 周，用含0.05%吐温-80的水溶液收集孢子并配制成1-10X IO5个孢子/ml的悬浮液，最 后将悬浮液接种至权利要求1或2所述的发酵培养基，悬浮液的体积为发酵培养基体积的 5-15%，接种后置于27°C培养15-16天，
[0009] 所述的三株高致病力和高产孢能力的扁座壳孢菌（Aschersonia placenta)菌株 分别为：
[0010] 扁座壳孢菌（Aschersonia. Placenta) YW3菌株，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为 CCTCC N0:M2013448 ;
[0011] 扁座壳孢菌（Aschersonia. Placenta)WD3菌株，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为 CCTCC N0:M2013447 ;
[0012] 扁座壳孢菌（Aschersonia. Placenta)ZJ5菌株，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏号为 CCTCC N0:M2013446。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] 1)本发明所提供的发酵培养基以花生饼粉为主要成分，该培养基非常适合扁座壳 孢菌发酵产孢，能大幅缩短扁座壳孢菌的产孢时间并提高产孢量，因此非常适于扁座壳孢 菌的规模化工业发酵生产，能够缩短生产周期，提高生产效率。
[0015] 2)本发明所提供的发酵培养方法得到的是一种高致病力和高含量的扁座壳孢菌， 对于粉虱类害虫的防治具有较好的应用前景。
[0016] 3)本发明所提供的发酵培养基原料来源广泛，价格低廉，有效降低了扁座壳孢菌 规模化生产的成本。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明进行详细地说明。
[0018] 实施例1菌株的筛选
[0019] 1.1材料来源
[0020] 在我国湖北、湖南、江西、浙江、四川、重庆、贵州、福建、广西、广东等柑橘主要产 区，采集被扁座壳孢菌侵染的柑橘粉虱虫尸。
[0021] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA):将200g马铃薯煮熟取汁，加入20g葡萄糖和20g 琼脂粉，加水定容至IOOOmL煮沸。后经灭菌锅灭菌（121 °C，30min)。
[0022] 无菌操作条件：所有器皿和用具须高压灭菌锅灭菌（12rC，30min)，接种等操作 在超净工作台内进行。
[0023] 培养条件：置于温度25°C，光照（16L :8D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到 PDA斜面，再转入4 °C冰箱贮存。
[0024] 1.2病原菌的分离、鉴定
[0025] L 2. 1 分离
[0026] 采用组织分离法，将子座从叶片上轻轻剥离下来，在无菌水中浸洗3-5次，然后 用70%的乙醇进行表面消毒，用刀片将子座分割成两半，一半用于切片观察，另一半切割 成2mm左右的切片，放入提前准备好的PDA平板培养基上，置于恒温恒湿培养箱中（温度 25°C，光照16L:8D)培养。待菌落形成后，转移到PDA斜面。再转入4°C冰箱贮存。
[0027] L 2. 2 复壮
[0028] 将分离到的菌株在PDA平板上培养20天，待形成菌落后用0. 05%的吐温-80无菌 水收集孢子，将孢子悬浮液在漩涡振荡器上搅拌，稀释成IX IO6个孢子/mL的孢子悬浮液， 用小型喷雾器均匀地喷于带有柑橘粉虱的橘苗叶片上，温度28±4°C，相对湿度80± 10%。 21天后按上述方法分离各个菌株。
[0029] 1.2. 3病原菌的鉴定
[0030] 根据病原菌的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定。
[0031] 将获得的60株扁座壳孢菌菌株分别接种到PDA平板上，于25°C条件下培养。 3-5天可见长出白色的菌丝，8天以后各菌株开始产孢，菌落颜色逐渐由白色变成橙黄色， 并形成粘孢团，各菌株生长速度存在差异，单菌落的最终大小也各不相同，直径范围在 18. 2mm-3. 5mm之间；菌落通常为垫状，白色或浅黄色，有的菌株有白色绒毛；产孢量丰富， 粘孢团散布在整个菌落表面或者是沿菌落边缘呈环形分布，浅黄色、黄色、橘黄色、橙色或 者橘红色；分生孢子纺锤形或梭形。
[0032] 1. 3扁座壳孢菌筛选
[0033] L 3. 1产孢量测定
[0034] 将浓度为I. OX IO7个孢子/mL的座壳孢菌株孢子悬浮液接种到盛有15mLPDA培 养基的培养皿（直径9cm)中，用三角玻璃棒涂匀，每个菌株三个重复。培养22d后，从菌落 核心至1/2处用直径为4. 5mm打孔器打孔取样，置入盛有ImL 0. 05%吐温-80无菌水的离 心管中，在涡旋器上搅拌5min，用四层纱布过滤后得孢子悬液，用无菌滴管滴于血细胞计数 板上，加放盖玻片，在显微镜下直接计数。从血细胞计数板上每个小方格中的孢子数可进一 步计算出3个重复单位面积产孢量的平均值。
[0035] L 3. 2菌丝干重
[0036] 将浓度I. 0 X IO7孢子/mL的孢子液20 μ 1接种于装有IOOmL液体培养基的250mL 锥形瓶中，置于25±1°C的恒温摇床（150rpm)上培养7d。将培养后的菌丝悬液进行真空抽 滤，于恒温干燥箱中80°C烘至恒重（24h)，称量菌丝干重。每个处理设置3次重复。
[0037] 1.3. 3高致病力菌株筛选
[0038] 供试菌株的处理：经纯化后的60株扁座壳孢菌接种于PDA培养基上，置于 25 ± I °C恒温培养箱中培养3周。
[0039] 供试昆虫与寄主植物：盆栽柑橘幼苗放置于温室中，室外采集柑橘粉虱接种于温 室纱网罩中的橘苗，形成稳定群体。选取每株长出5-6片嫩叶的无虫柑橘盆栽，用清水将所 有嫩叶清洗干净，自然晾干，放入纱网罩中，置于有柑橘粉虱的橘苗下24小时。然后驱除所 有粉虱成虫，置于无虫环境下。45d左右大部分粉虱可发育到3龄若虫期。
[0040] 扁座壳孢菌致病力：配制5.0 X 105,1. OX 106, 5. OX IO6和I. OX 10 7个孢子/mL 4种浓度的孢子悬浮液，每片嫩叶喷洒孢子悬浮液lmL。每个菌株设3次重复。同时以含 0. 05%吐温80的无菌水喷洒2片叶片作为对照处理，重复3次。温室条件：温度28±4°C， 相对湿度80± 10%。进行连续观察，每3天计数一次，连续观察3周。然后将叶片摘下，在 显微镜下观察记录试虫的最终死亡数量。
[0041] 以上试验数据均在数据处理软件SPSS16. 0系统上处理完成。
[0042] 1. 3. 4扁座壳孢菌高致病力菌株筛选结果
[0043] 在筛选优良扁座壳孢菌时，致病力高低是重要的参考指标，产孢量和菌丝量次 之。本发明中菌株YW3对柑橘粉虱的侵染率最高，WD3、ZJ5侵染率次之，同时WD3、ZJ5菌 株产孢量较高。综合比较各方面因素，YW3、WD3、ZJ5为最佳菌株。上述三株扁座壳孢菌于 2013年9月26日在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏 号分别为 CCTCC N0:M2013448、CCTCC N0:M2013447、CCTCC N0:M2013446。该扁座壳孢菌 (Aschersonia. Placenta)属腔抱纲（Coelomycetes)、座壳抱属（Aschersonia)0
[0044] 表1扁座壳孢菌对柑橘粉虱若虫的侵染率及其生物学特性
[0045]
【权利要求】
1. 一种扁座壳孢菌的规模化生产发酵培养基，其特征在于由以下重量百分比的成分组 成：花生饼粉15-25%，葡萄糖0. 05-0. 2%，胰蛋白胨0. 05-0. 2%，水为余量。
2. 如权利要求1所述扁座壳孢菌的规模化生产发酵培养基，其特征在于所述成分的重 量百分比是：花生饼粉20%，葡萄糖0. 1%，胰蛋白胨0. 1%，水为余量。
3. -种高致病力扁座壳孢菌的规模化生产发酵培养方法，其特征在于：首先从柑橘粉 虱虫尸上筛选分离出三株高致病力和高产孢能力的扁座壳孢菌（Aschersonia placenta) 菌株，然后将该三株菌株中的一种接种于PDA培养基上，置于25 ± 1°C恒温培养箱中培养 2-4周，用含0. 05%吐温-80的水溶液收集孢子并配制成1-10 X 105个孢子/ml的悬浮液， 最后将悬浮液接种至权利要求1或2所述的发酵培养基，悬浮液的体积为发酵培养基体积 的5-15%，接种后置于27°C培养15-16天， 所述的三株高致病力和高产孢能力的扁座壳孢菌（Aschersonia placenta)菌株分别 为： 扁座壳孢菌（Aschersonia. Placenta) YW3菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏号为 CCTCC N0:M2013448 ; 扁座壳孢菌（Aschersonia. Placenta)WD3菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏号为 CCTCC N0:M2013447 ; 扁座壳孢菌（Aschersonia. Placenta)ZJ5菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏号为 CCTCC N0:M2013446。
【文档编号】C12R1/645GK104498366SQ201410663655
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】张宏宇, 张为丽 申请人:华中农业大学