疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的制作方法【专利摘要】本发明公开一种疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，该启动子属于组织特异性表达启动子，该启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥的叶片特异表达。该启动子可以应用于水稻抗白叶枯病育种，通过驱动其它外源基因尤其是抗白叶枯病基因在转基因水稻叶片中集中特异表达，从而提高水稻对白叶枯病的抗性。同时，该启动子对于应用于水稻其它叶面病害的防治具有重要的理论及实际意义。【专利说明】疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种由疣粒野生稻中克隆的抗白叶枯病相关基因Me094启动子，属于分子生物学【
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背景技术：
】[0002]基因的表达和调控是植物基因工程研究的重要内容之一，启动子作为一种重要的调控元件，调控着外源基因在转基因植物的特定组织、特定发育阶段和一定环境条件下的表达。利用基因工程技术将相关抗性基因导入植物，从而使植物抵御各种生物或非生物胁迫，是实现植物抗逆性改良的较好途径，而启动子的配置和外源基因的按需表达则显得非常重要。目前在植物转基因研究中最广泛采用的启动子有来源于花椰菜花叶病毒（CaMV)的35S启动子（OdellJT,etal,IdentificationofDNAsequencesrequiredforactivityofthecauliflowermosaicvirus35Spromoter[J].Nature,313(6005):810-812,1985)，玉米泛素基因（Ubil)启动子（ChristensenAHetal,Maizepolyubiquitingenestructurethermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation[J]·PlantMolBiol,18(4):675-689,1992)等，它们都属于组成型启动子，即在这类启动子控制下，外源基因在转基因植株的各个组织、各个发育阶段都会持续表达。这不仅造成了能量的浪费，而且对植物的生长发育也有不利的影响。[0003]寻找专一性启动子，使外源基因特异地表达是植物基因工程的关键环节。组织特异性启动子作为一类专一性启动子，能调控外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达，它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物能量的不必要浪费（杨予涛等，一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析[J].中国科学C辑，33(4):298-306,2003)。[0004]叶片是水稻的主要营养器官，同时也是白叶枯病的主要发生器官。因此，在水稻白叶枯病抗性改良中，使抗病基因在叶片中特异表达，不仅避免了基因产物的浪费，同时还能提高水稻植株的抗性，进而提高水稻产量和品质。而找到能调控抗病基因在水稻叶片特异性表达的启动子，则是解决这一问题的关键。[0005]我们在疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导的抑制差减文库（SSH)中，克隆了一个抗白叶枯病相关基因Me094,该基因编码金属硫蛋白。金属硫蛋白是一种小分子量，富含半胱氨酸的重金属结合蛋白，参与植物中的金属代谢和过多的重金属的解毒，此外也参与植物的胁迫保护反应（RobinsonNJetal,Plantmetallothionein[J]·Biochem,295:1-10,1993;CarginaleV,etal,Cadmium-induceddifferentialaccumulationofmetallothioneinisofonnsintheAntarcticicefishwhichexhibitsnobasalproteinbuthighendogenousmRNAlevels[J].Biochem.J,332:475-81,1998)。通过研究发现，Me094在转基因水稻中的表达能提商水稻的抗白叶枯病能力，用RNAi干扰技术干扰Me094基因的表达后，转基因水稻的抗病能力明显减弱。这些结果表明Me094参与了疣粒野生稻抗白叶枯病过程。本发明所述的启动子即是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，它是一个叶片特异表达的启动子。目前，已成功克隆了多个叶片特异表达启动子，如Rbcs(1，5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶小亚基基因）启动子，Cab(捕光叶绿素a/b结合蛋白基因）启动子等，这些启动子的利用不同程度地提高了目的基因在叶片的特异表达。[0006]热不对称交错PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR，简称TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术由Liu和Whitter首先石开究并?艮道（LiuYGetal，ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentfromPlandYACclonesforchromosomewalking[J]·Genomics,25:674-681，1995)。利用该技术分离出的DNA序列可用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针，也可以直接测序。近年来，由此形成的技术路线已成功地用于从PUYAC和BAC克隆中分离获得插入末端的DNA序列，拟南芥的T-DNA侧翼序列及多个基因的启动子序列，并且取得了显著成效。【
发明内容】[0007]本发明的目的是提供一新的疣粒野生稻中抗白叶枯病相关基因Me094的上游启动子序列，以及该启动子在驱动外源基因尤其是抗病基因在转基因植物的叶片特异表达，从而提高转基因植物抵御病害能力上的应用。[0008]本发明针对上述研究背景，根据已克隆了的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094序列，通过TAIL-PCR技术分离克隆了该基因的上游启动子，并采用农杆菌介导法转化拟南芥进行启动子功能研究。[0009]本发明所提供的一种疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0010]本发明还提供了上述疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在驱动外源抗病基因在转基因植物的叶片特异表达提高转基因植物抵御病害能力上的应用。[0011]所述的提1?转基因植物抵御病害能力上的应用为提1?转基因水稻抵御白叶枯病害能力上的应用。[0012]本发明还提供了上述疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在转基因拟南芥中驱动下游基因叶片特异表达的应用。[0013]本发明还提供了一种扩增本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5组成，引物AD1的碱基序列如SEQIDNO:2所示，引物AD2的碱基序列如SEQIDNO:3所不，引物AD3的喊基序列如SEQIDNO:4所不，引物AD4的喊基序列如SEQIDNO:5所示，引物AD5的碱基序列如SEQIDNO:6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3组成，所述引物ME094-1的碱基序列如SEQIDNO:7所示，引物ME094-2的碱基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的碱基序列如SEQIDNO:9所示。[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果：[0015]本发明通过TAIL-PCR技术首次从疣粒野生稻中克隆获得抗白叶枯病相关基因Me094启动子，该启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥的叶片特异表达，属于组织特异性表达启动子。本发明发掘的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因启动子，可以应用于水稻抗白叶枯病育种，对于驱动其它外源基因尤其是抗白叶枯病基因在转基因水稻叶片中集中特异表达，从而提高水稻对白叶枯病的的抗性具有重要的理论及实际意义。同时该启动子也可以应用于水稻其它叶面病害的防治。[0016]序列表中SEQIDNO:1所示的是本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的核苷酸序列。[0017]序列表中SEQIDNO:2所示的是引物ADl的碱基序列。[0018]序列表中SEQIDNO:3所示的是引物AD2的碱基序列。[0019]序列表中SEQIDNO:4所示的是引物AD3的碱基序列。[0020]序列表中SEQIDNO:5所示的是引物AD4的碱基序列。[0021]序列表中SEQIDNO:6所示的是引物AD5的碱基序列。[0022]序列表中SEQIDNO:7所示的是引物ME094-1的碱基序列。[0023]序列表中SEQIDNO:8所示的是引物ME094-2的碱基序列。[0024]序列表中SEQIDNO:9所示的是引物ME094-3的碱基序列。[0025]序列表中SEQIDNO:10所示的是Me94Pr-l引物的碱基序列。[0026]序列表中SEQIDNO:11所示的是Me94Pr-2引物的碱基序列。[0027]序列表中SEQIDNO:12所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的cDNA全长的核苷酸序列。[0028]序列表中SEQIDNO:13所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094编码的氨基酸序列。[0029]序列表中SEQIDNO:14所示的是Me094的EST序列上游引物Me094-E(+)的碱基序列。[0030]SEQIDNO:15所示的是Me094的EST序列下游引物Me094-E(_)的碱基序列。[0031]SEQIDNO:16所示的是接头引物AP的碱基序列。[0032]SEQIDNO:17所示的是Me094的ORF序列上游引物Me094-F(+)的碱基序列。[0033]SEQIDNO:18所示的是Me094的ORF序列下游引物Me094-F(_)的碱基序列。[0034]SEQIDNO:19所示的是Me094基因的3'端核苷酸序列。[0035]SEQIDNO:20所示的是Me094基因的5'端核苷酸序列。[0036]SEQIDNO:21所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的EST序列。【专利附图】【附图说明】[0037]图1:本发明启动子序列的TAIL-PCR扩增图谱。图中MJPM2分别DL15000Marker和DL2000Marker，1、3、5、7、9泳道分别为引物AD1-AD5的第2轮扩增产物，2、4、6、8、10泳道分别为引物AD1-AD5的第3轮扩增产物。[0038]图2:本发明启动子表达载体的PCR鉴定（左）及HindIII和XbaI双酶切鉴定(右）图谱。图中M为DL2000Marker，1为非转基因植株对照，2为质粒对照，3-8为转基因阳性植株。[0039]图3:本发明启动子表达载体转入农杆菌后的菌液PCR鉴定图谱。图中M为DL2000Marker，1-4为4个不同的农杆菌单克隆。[0040]图4:本发明启动子表达载体转入拟南芥后的PCR检测图谱。图中M为DL2000Marker，1为非转基因对照，2-8为转基因植株。[0041]图5:本发明启动子表达载体转入拟南芥后的GUS化学染色图谱。图中1为非转基因对照，2为转入空载体pBI121的对照，3-4为转基因植株。3-4中箭头所指是蓝色较深的部位。[0042]图6:含有Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI_Me094图谱。[0043]图7:转Me094基因水稻的DNA的PCR检测阳性植株图，图中M为DL2000Marker，1为阳性对照，2为阴性对照，3-15为再生植株。[0044]图8:Me094基因的半定量RT-PCR显示图。图中β-Acti是内参基因，CK、24h、48h、72h、96h、120h分别为接无菌水对照、白叶枯病病原菌处理24h、48h、72h、96h、120h的cDNA半定量RT-PCR的扩增结果。【具体实施方式】[0045]以下各实施例无特殊说明均为常规方法。[0046]实验材料：抚粒野生稻（Oryzameyeriana),白叶枯病菌Cl是中国典型的致病菌株，白叶枯病菌Y8是云南省典型的致病菌株，用所述白叶枯病菌Cl和白叶枯病菌Y8接种是利用其对水稻的侵染能力的共性从而导致水稻叶片形成白叶枯病病斑，因此，具有同样致病能力的各种白叶枯病菌菌株都能达到本发明的效果。以下各实施例的实验试剂等均为市售产品。[0047]实施例1-实施例2是本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的克隆、序列分析及功能验证。实施例3-实施例7分别是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的表达序列标签的验证和表达分析、基因Me094全长的克隆、含目的Me094基因重组农杆菌的获得、含目的Me094基因农杆菌介导的水稻遗传转化、转目的Me094基因再生植株的分子生物学检测和抗性鉴定。[0048]实施例1疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的克隆及分析[0049](1)设计扩增Me094启动子的引物[0050]Me094基因是本申请人:前期从疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导的SSH文库中筛选克隆出来的1个金属硫蛋白基因，已进行了功能验证，但其上游启动子序列未知，从而限制了对该基因表达调控情况的研究。根据Me094基因全长cDNA序列信息，再结合TAIL-PCR技术的原理，用生物软件Primer5.0设计引物对Me094基因启动子进行扩增，Me094基因全长cDNA的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:12所示，设计的扩增本发明启动子（即疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子）的引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5组成（即5条随机简并上游引物），引物ADl的喊基序列如SEQIDNO:2所不，引物AD2的喊基序列如SEQIDNO:3所不，弓丨物AD3的碱基序列如SEQIDNO:4所示，引物AD4的碱基序列如SEQIDNO:5所示，引物AD5的碱基序列如SEQIDN0:6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3组成（即3条嵌套的特异性下游引物），所述引物ME094-1的碱基序列如SEQIDNO:7所示，引物ME094-2的碱基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的碱基序列如SEQIDNO:9所示。[0051](2)以接种白叶枯病菌处理的疣粒野生稻叶片提取总DNA[0052]对疣粒野生稻叶片用白叶枯病菌Cl和Y8进行接菌处理，分别于24h、48h、72h、96h、120h5个时期取样，然后将样品等量混合后用CTAB法提取其叶片DNA，具体如下：[0053]1)取0.2g疣粒野生稻接菌后的混合样品加液氮研磨至粉末状，加入Iml提取缓冲液（2%CTAB，100mMTris-cLPH8·0,20mMEDTAPH8·0，l·4MNaCl)置于65°C保温60-90min，其间不断摇匀；[0054]2)取出后12000rpm离心10min(4°C);[0055]3)离心结束后将上清液转到另一干净离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，其间不断摇匀；[0056]4)静置片刻后12000rpm离心10min(4°C)，取出上清液加入2/3体积的异丙醇置于-20°C进行沉淀约30min;[0057]5)5000印111离心5111；[11(41€)，弃去上清液，加入1111175%的酒精洗漆沉淀，重复二次；[0058]6)然后将离心管在室温无菌风干至透明状，加入50μITE(K)OmMTris-clΡΗ4.0,ImMEDTA)或CldH2O溶解沉淀，加入2μIRNA酶；[0059]7)取3μ1上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用分光光度计测定其浓度。[0060](3)疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ΜΕ094启动子的扩增[0061]以步骤⑵所提取的DNA作为PCR反应的模板，浓度稀释到0.Iyg/μ1，以步骤1中设计的引物作为PCR反应引物，即分别以3条下游引物：引物ΜΕ094-1、引物ΜΕ094-2和引物ΜΕ094-3和5条上游随机引物：引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5配对，做3轮TAIL-PCR扩增反应，扩增疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子。[0062]①第1轮PCR反应，反应体系：10XLAPCRBuffer(Mg2+Plus)2μ1，dNTPMixture(2.5mMeach)1.6yl，模板DNA25ng，特异弓丨物（Me094-l)0.2uM，随机引物（AD1-AD5)各4uM，LATaq聚合酶I.0U，CldH2O补足到20μ1。反应条件：93°Clmin,95°Clmin，然后5个循环（94°C30s，6(TClmin，72°C2min)，94°C30s，3(TC3min，Rampingto72°C(0.2t：/s)2min。最后15个循环（94°C30s，62°Clmin，72t：2min;94°C30s，62°Clmin，72°C2min;94°C30s，44°Clmin，72°C2min)，72°ClOmin。[0063]②第2轮PCR反应：[0064]将第I轮PCR产物稀释50倍作为第2轮PCR的模板。反应体系同步骤⑶①，只是模板改为第1轮PCR产物稀释液1μ1，特异引物改为Me094-2,随机引物改为2μM。反应条件：15个循环（94°C30s，6(TClmin，72°C2min;94°C30s，6(TClmin，72°C2min;94°C30s，44°Clmin，72°C2min)，72°ClOmin。[0065]③第3轮PCR反应：[0066]将第2轮PCR产物稀释50倍作为第3轮PCR的模板，反应体系同步骤（3)②，模板改为第2轮PCR产物稀释液1μ1，特异引物改为Me094-3。反应条件：15个循环（94°C30s，61°Clmin,72〇C2min；94〇C30s,61°Clmin,72〇C2min；94〇C30s,44°Clmin,72〇C2min),72°C10min〇[0067](4)Me094基因启动子片段的回收[0068]图1为本发明启动子的PCR扩增结果，结果显示除引物AD3外，其它引物的第3轮PCR产物都有较特异的条带，将它们用I%琼脂糖凝胶电泳，然后进行凝胶回收，具体方法如下：[0069]1)在紫外灯下将目的条带切下，尽量除去不含DNA片段的凝胶，置于I.5ml的离心管中，称重；[0070]2)按每IOOmg胶块加入300μ1溶胶液的比例加入溶胶液，置于50°C水浴中IOmin,期间不断摇动混勻；[0071]3)胶块完全溶解后将溶胶液转移到吸附柱中，室温，8000rpm离心30s，去掉废液；[0072]4)向吸附柱中加入500μ1漂洗液，室温，9000rpm离心30s，去掉废液；[0073]5)重复步骤4,9000rpm离心Imin,倒掉废液；[0074]6)将吸附柱移至干净的I.5ml离心管中，室温放置5min左右，使残余漂洗液中的乙醇挥发；[0075]7)向吸附柱中央加入15-4(^1提前预热至601：的洗脱缓冲液，室温放置1-21^11，9000rpm离心Imin洗脱DNA，即获得疣粒野生稻受白叶枯病菌胁迫表达的基因Me094的启动子片段，即为本发明所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子。[0076](5)本发明启动子片段的克隆测序及分析[0077]将步骤（4)中获得的Me094基因启动子片段回收产物分别与pMD18-T载体连接，反应体系为：4μ1回收产物，1μIpMD18-T，5μIsolutionI，16°C连接30min或过夜，次日将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于添加了Amp、IPTG和X-gal的LB平板上，37°C倒置培养12-16h，进行蓝白斑筛选。待培养基上长出单克隆后，挑取白色单克隆于3ml液体LB中（含lmg/mlAmp)，37°C，200r/min振荡培养14h-16h，用碱裂解法提取质粒。[0078]提取的质粒用EcoRI和SalI进行双酶切鉴定，反应体系为：10XHBufferΙμ?，质粒4yl，EcoRI和SalI各0.5μ1，补足ddH20至1(^1。371：反应3h，结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果Me094启动子克隆载体大多数都能切出与理论值相符的条带，将酶切鉴定正确的克隆送到上海生工测序。[0079]对测序结果用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/进行在线分析，结果表明本实验获得了Me094基因1761bp的启动子序列，序列如SEQIDNO:1所示。该启动子序列中位于第516碱基至第565碱基，第602碱基至第651碱基，第1187碱基至第1237碱基分别为预测的基础启动子序列；位于第556碱基，第642碱基，第1228碱基分别为预测的转录起始位点；有4个TATA-box，分别位于第526碱基至第531碱基，第539碱基至第543碱基，第896碱基至第899碱基，第1417碱基至第1420碱基；有3个CAAT-box元件，分别位于第324碱基至第328碱基，第728碱基至第731碱基，第829碱基至第832碱基；位于第1535碱基至第1537碱基是翻译起始密码子ATG(详见序列表）。[0080]说明本实验所获得的序列的确是抚粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME094的上游启动子序列。[0081]实施例2构建本发明Me094启动子高效表达载体，转化拟南芥研究该启动子功能[0082]l.Me094启动子表达载体的构建[0083]在获得Me094启动子序列基础上构建该启动子表达载体，即用Me094启动子替换载体PBI121上的35S启动子（载体pBI121为市售）。根据pBI121上35S启动子两侧的酶切位点和Me094启动子的序列分析结果，用HindIII和XbaI分别酶切pBI121和Me094启动子克隆载体，酶切体系为：[0084]【权利要求】1.疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在驱动外源抗病基因在转基因植物的叶片特异表达以提高转基因植物抵御病害能力上的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的提高转基因植物抵御病害能力上的应用为提高转基因水稻抵御白叶枯病害能力上的应用。4.权利要求1所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在转基因拟南芥中驱动下游基因叶片特异表达上的应用。5.-种扩增权利要求1所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5组成，引物AD1的碱基序列如SEQIDNO:2所示，引物AD2的碱基序列如SEQIDNO:3所不，引物AD3的喊基序列如SEQIDNO:4所不，引物AD4的喊基序列如SEQIDN0:5所示，引物AD5的碱基序列如SEQIDN0:6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3组成，所述引物ME094-1的碱基序列如SEQIDN0:7所示，引物ME094-2的碱基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的碱基序列如SEQIDNO:9所示。【文档编号】C12N15/113GK104404043SQ201410673732【公开日】2015年3月11日申请日期:2014年11月21日优先权日:2014年11月19日【发明者】李定琴,程在全,钟巧芳,肖素勤,柯学,李维蛟,余腾琼,张敦宇,付坚,王玲仙,陈玲,陈越,蒋聪,罗红梅,曾民,王波,黄兴奇申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所