一种可同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种能够同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌，该菌株命名为YC-YH1，保藏编号为CGMCC No.9624。该菌能够在4天内将无机盐培养基中同时含有的100mg/L浓度毒死蜱和100mg/L浓度萘的混合物同时100％降解。本发明的施氏假单胞菌株YC-YH1能够应用于毒死蜱或萘污染环境及二者共同污染环境的生物修复，具有较好的经济价值和应用前景。CGMCC No962420140829
【专利说明】一种可同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及生物降解领域，具体地，涉及一种施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri) YC-YH1 及其应用。
【背景技术】
[0002] 毒死蜱（chlorpyrifos)，化学名称：0,0-二乙基-0-(3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫 逐磷酸酯，是美国陶氏化学公司于1965年开发并研制出来的一种广谱性有机磷酸酯类杀 虫剂，广泛应用于叶菜类和瓜果类蔬菜的病虫害防治，是目前全球使用最广泛的5种杀虫 剂之一。随着毒死蜱在我国产销量的逐年增加和使用范围的不断扩大，必然对出口农产品 的产生不利影响，危害人畜健康，并对水、土壤等环境带来严重污染。因此，如何有效地处理 毒死蜱的毒性和残留带来的污染，成为人们亟待解决的问题。
[0003] 萘（naphthalene)是一种结构最简单的、具有两个苯环的多环芳经（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)，是美国环保署鉴定的优先控制的16种PAHs污染物之一， 在环境中普遍存在，常用做研究PAHs环境降解的模式化合物。萘具有较低的水溶性和较高 的固液分配系数，这使得它能够抵抗微生物的利用且促进其在土壤中的浓度的增加。随着 石油工业和消耗的增加，环境中PAHs的浓度逐渐增加，对人类健康造成了严重威胁。
[0004] 施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri)是一种普遍存在的具有较高遗传适应性 的细菌，它存在于很多不同的环境中。根据国内外文献报道，该菌株能够降解多种外源物 质，如苯甲酸、苯磺酸、萘、甲酚、菲、二甲酚、芘等，该种菌具有用于生物修复的潜力。目前尚 未见有对毒死蜱和萘两种不同物质同时具有降解作用或相关作用的报道。
[0005] 近几十年来，人们对单一污染物的生物降解进行了相当详细的研究，并取得了许 多相应的成果。事实上，在自然界中绝对意义的单一污染是不存在的，污染多有伴生性和综 合性的特点，所以单个污染物的生物降解研究虽具有一定的参考意义，但尚不能完全解决 污染问题。在土壤及水环境的微生物生物修复实际应用中，要考虑到所选菌株本身所具有 的对多种化合物共同降解的能力，这样既能实现生物修复的高效率，同时也能降低经济成 本。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一株能够同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌。
[0007] 本发明从活性污泥中分离到一株能够同时降解毒死蜱和萘的菌株。活性污泥样品 采集于农药厂的排污口（河北邢台）。在无菌操作条件下，将3?5g活性污泥样品接种到 用含毒死蜱浓度为l〇〇mg/L的无机盐培养中，在25?35°C，150?200rpm条件下培养，每 培养6?10天后，取培养体积的10%?15%转接至新鲜无机盐培养基中，且每次将毒死 蜱农药浓度提高l〇〇mg/L，连续转接5?8次，直至无机盐培养基中农药浓度提高到500? 800mg/L。用无菌水将驯化后的菌液梯度稀释10_ 5、10_6、KT7后分别涂布到含有200mg/L毒 死蜱的无机盐培养基平板上，30°C培养箱中培养6?10天。挑取在平板上的单菌落进行划 线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株。选择在含农药培养基上生长好、传代稳定 且降解能力较好的菌株进行斜面保存。
[0008] 通过菌株形态学特征，生理生化特征和16S rRNA序列分析将该菌株鉴定为施氏假 单胞菌，命名为YC-YHl，该菌株于2014年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 9624,分类名为施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri 〇
[0009] 本发明提供的施氏假单胞菌YC-YHl革兰氏染色为阴性杆菌，菌体细长、直或微 弯，无芽孢，在LB培养基上菌落为淡黄色，干燥，扁平，边缘不整，不透明，表面粗糙，有折 皱；培养48h后，菌落会粘附于培养基上。LB培养基上菌落形态见图1。
[0010] 本发明提供了含有施氏假单胞菌YC-YHl的菌剂。
[0011] 本发明提供了含有施氏假单胞菌YC-YHl的生物清洁剂。
[0012] 本发明提供了施氏假单胞菌YC-YHl或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在清 洁环境中的应用。
[0013] 进一步，本发明提供了施氏假单胞菌YC-YHl或含有其的菌剂或含有其的生物清 洁剂在降解污染物中的应用。
[0014] 所述的污染物为毒死蝶和/或萘。
[0015] 本发明提供了施氏假单胞菌YC-YHl在制备生物清洁剂中的应用。
[0016] 本发明提供了施氏假单胞菌YC-YHl在制备生物降解剂中的应用。
[0017] 本发明的施氏假单胞菌YC-YHl能够在4天内100%降解无机盐培养基中含有的浓 度为100mg/L萘，在5天内分别100%降解无机盐培养基中单独含有的浓度为100mg/L的毒 死蜱和甲基对硫磷，在7天内对无机盐培养基中单独含有的浓度为100mg/L的三唑磷、氯氰 菊酯、三氟氯氰菊酯、菲和芴的降解率分别为57%、48%、39%、62%和37%。
[0018] 另外，本发明的施氏假单胞菌YC-YHl可在4天内100%降解无机盐培养基中同时 含有的浓度为l〇〇mg/L的毒死蜱和100mg/L的萘的混合污染物，菌株YC-YHl对萘的降解促 进了其对毒死蜱的降解速率。本发明提供的施氏假单胞菌YC-YHl及其菌剂在使用过程中 无污染，无公害，能够应用于毒死蜱或萘污染环境及二者共同污染环境的生物修复，可广泛 应用于环境清洁领域，具有较好的经济价值和应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为本发明施氏假单胞菌YC-YHl在LB固体培养基上的菌落形态。
[0020] 图2为施氏假单胞菌YC-YHl的系统发育树。
[0021] 图3为HPLC法检测同时含100mg/L毒死蜱和100mg/L萘的混合物的色谱图。
[0022] 图4为标准曲线图，其中图4A为萘的标准曲线图，图4B毒死蜱的标准曲线图。
[0023] 图5为施氏假单胞菌YC-YHl在无机盐培养基中同时降解100mg/L毒死蜱和 100mg/L萘的混合物的降解图。
[0024] 图6为毒死蜱代谢产物的LC-MS检测扫描图谱。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0026] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027] 本申请使用的无机盐培养基具有以下组成：1. Og/L NH4NO3, 0.5g/L NaCl，0.5g/ L(NH4)2SO4, 0· 5g/L KH2PO4, I. 5g/L K2HPO4 和 0· 005g/L 酵母提取物，pH = 7· 0±0· 2。
[0028] 斜面培养基：10. Og/L 蛋白胨，5· Og/L NaCl，10. Og/L酵母提取物，pH = 7· 0±0· 2。
[0029] 平板培养基为相应的培养基中加入1. 5%的琼脂。
[0030] 实施例1施氏假单胞菌YC-YHl的分离和鉴定
[0031] 1、菌株的分离
[0032] 活性污泥样品采集于农药厂的排污口（河北邢台）。在无菌操作条件下，将5g活 性污泥样品接种到用含毒死蜱浓度为l〇〇mg/L的无机盐培养基中，在30°C，ISOrpm条件下 培养，每培养7天后，取培养体积的10%转接至新鲜无机盐培养基中，且每次将毒死蜱农药 浓度提高l〇〇mg/L，连续转接8次，直至无机盐培养基中农药浓度提高到800mg/L。
[0033] 用无菌水将驯化后的菌液梯度稀释10'10'KT7后分别涂布到含有200mg/L毒 死蜱的无机盐培养基平板上，30°C培养箱中培养7天。挑取在平板上的单菌落进行划线后 培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株。在含浓度为200mg/L毒死蜱的无机盐培养基平 板上生长好、传代稳定且降解能力较好的菌株进行斜面保存。菌株命名为YC-YH1。
[0034] 2、菌株的形态学特征
[0035] 该菌为革兰氏染色为阴性杆菌，菌体细长、直或微弯，无芽孢，在LB培养基上菌落 为淡黄色，干燥，扁平，边缘不整，不透明，表面粗糙，有折皱；培养48h后，菌落会粘附于培 养基上，见图1。
[0036] 3、菌株生理生化特性
[0037] 表1生化反应表
【权利要求】
1. 一种施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri) YC-YH1，其保藏编号为 CGMCC No. 9624。
2. 含有权利要求1所述施氏假单胞菌YC-YH1的菌剂。
3. 含有权利要求1所述施氏假单胞菌YC-YH1的生物清洁剂。
4. 权利要求1所述的施氏假单胞菌YC-YH1或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所 述的生物清洁剂在清洁环境中的应用。
5. 权利要求1所述的施氏假单胞菌YC-YH1或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所 述的生物清洁剂在降解污染物中的应用。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的污染物为毒死蜱和/或萘。
7. 权利要求1所述的施氏假单胞菌YC-YH1在制备生物清洁剂中的应用。
8. 权利要求1所述的施氏假单胞菌YC-YH1在制备生物降解剂中的应用。
【文档编号】C12R1/38GK104388352SQ201410680633
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】闫艳春, 史延华, 任磊, 贾阳 申请人:中国农业科学院研究生院