Bcr-abl融合基因快速检测方法的引物和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种BCR-ABL融合基因快速检测方法的引物和试剂盒，本发明提供了用环介导等温扩增方法检测BCR-ABL基因的引物，建立了白血病微小残留病BCR-ABL基因检测新方法。扩增效率高、特异性好、对仪器设备要求低，只需要恒温水浴锅即可，临床上容易做到，检测时间不超过1个小时，是一种快速、准确诊断基因的新方法。本试剂盒实现了基因扩增和结果判定一步完成，操作简单、结果准确直观、特异性与敏感性高、对人体安全、不污染环境，适合于各级医院快速诊断白血病微小残留病，排除了基层医院难以开展此类检查的障碍，患者可以就近检查，而不用再长途奔波到条件好的大医院，方便了患者，节省了费用，为救治生命节约了宝贵时间。
【专利说明】BCR-ABL融合基因快速检测方法的引物和试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因的快速检测方法，尤其涉及一种BCR-ABL融合基因快速检测方法 的引物和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 白血病是一种造血系统恶性疾病，严重危害人类健康。随着医学进步，白血病经过 积极治疗，多数患者能取得缓解，但很多患者缓解后体内仍残留少量白血病细胞，即存在白 血病微小残留病（MRD)。白血病微小残留病是白血病复发的首要原因。白血病患者完全缓 解后，检测体内残留白血病细胞，可以预防及防止复发，指导个性化治疗，因此，对患者进行 白血病微小残留病监测具有重要意义。
[0003] 慢性粒细胞白血病（CML)是骨髓造血干细胞恶性克隆增生性疾病，约95% CML可 发生t (9 ;22) (q34 ;qll)基因易位，形成BCR-ABL融合基因，BCR-ABL融合基因编码的蛋白 具有升高酪氨酸激酶活性，在CML的病理过程中起重要作用，其表达可作为微小残留病的 标志。既往多用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR)检测BCR-ABL融合基因。PCR存在反应后 要开盖进行后续检测，常存在污染和非特异性扩增导致的假阳性，另外还存在耗时长、操作 复杂、劳动强度大、重复性差、定量标准不统一，并且检测需要4-5个小时，而且PCR结束之 后需要通过电泳判断结果，电泳所用DNA染料EB有剧毒等诸多缺点。
[0004] 环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是 2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循 环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点，可以不依赖任何专门的仪器 设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，该方法推广期主要面对微 生物检测，现在已经广泛应用于微生物检测领域，并有很多相关专利获得授权，但因研究人 员了解不足，而且人体基因比微生物更复杂，目前国内外均未见使用LAMP方法检测白血病 BCR-ABL基因的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种BCR-ABL融合基因快速检测方法 的引物和试剂盒。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种BCR-ABL融合基因快速检测方法的引物，包括：引物Pl，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1所示；引物P2,其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；引物P3,其核苷酸序列如SEQID NO :3所示；引物P4,其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0008] 上述引物在检测慢性粒细胞白血病微小残留病中的应用。
[0009] 一种BCR-ABL融合基因快速检测方法的试剂盒，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性 对照，所述 LAMP 反应液的成分为：0. 04ymol/yL pH 为 8. 8 的 Tris-HCl，0. 02ymol/yL 的 KC1，0. 016μπιο1/μ L 的 MgS04,0 . 02μπιο1/μ L 的（HN4)2S04,0 . 00 2μ l/μ L 的 Tween20, 1.6ymol/yL WSf 0. 0028 μ mol/μ LX 4 ^ dNTPs, IOU/μ L ^g|, 8U/μ L ^Bst 0嫩聚合酶，0.00005以111〇1/^1^的钙黄绿素，1.6?111〇1/^1^的引物？1，1.6?111〇1/^1^的引物 Ρ2,0· 2pmol/y L 的引物 Ρ3,0· 2pmol/y L 的引物 P4 ;
[0010] 所述阳性对照为：反应时在反应液中加入BCR-ABL基因表达阳性的Κ562细胞基因 组 RNA ;
[0011] 阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。
[0012] 上述试剂盒中LAMP反应液为Iml、阳性对照50 μ L、阴性对照Iml。
[0013] 上述试剂盒还包括：反应管50个，1-10 μ L移液器头100个。
[0014] 上述试剂盒的使用方法：取20 μ L反应液置于反应管中，将5 μ L待检RNA加入反 应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条 件为：60-65°C水浴恒温反应40-45min，观察颜色变化；用户在初次使用时需要设置阴性对 照和阳性对照。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 为了解决以往白血病微小残留病检测中易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检 测时间长的问题，本发明提供了用环介导等温扩增方法检测BCR-ABL基因的引物，建立了 白血病微小残留病BCR-ABL基因检测新方法。
[0017] 该方法扩增效率高、特异性好、对仪器设备要求低，只需要恒温水浴锅即可，临床 上容易做到，检测时间不超过1个小时，是一种快速、准确诊断基因的新方法。
[0018] 反应液中预先加有逆转录酶，逆转录和基因扩增一步完成，而不需要预先将RNA 逆转录成cDNA再进行DNA扩增，简化了操作步骤。
[0019] 采用本试剂盒通过检测BCR-ABL基因诊断CML微小残留病，从取得样本到结果判 定结束可以控制在2h内，采用本试剂盒，实现了基因扩增和结果判定一步完成，操作简单、 结果准确直观、特异性与敏感性高、对人体安全、不污染环境，适合于各级医院快速诊断慢 性粒细胞白血病微小残留病，排除了基层医院难以开展此类检查的障碍，患者可以就近检 查，而不用再长途奔波到条件好的大医院，方便了患者，节省了费用，为救治生命节约了宝 贵时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为裸眼目视观察反应结果，其中，1号管为检测管，2号管为阳性对照，3号管为 阴性对照；
[0021] 图2为LAMP法目视检测试剂盒灵敏性结果，其中，1-5号管中加入的为倍比稀释的 RNA，浓度依次为1000、100、10、1、0. Ing/μ 1，1-4号为阳性，5号为阴性；
[0022] 图3为LAMP法目视检测试剂盒特异性结果，1-5号管为CML患者样本，6-10号管 为正常人样本；1-5号为阳性，6-10为阴性。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0024] 1.材料与方法
[0025] I. 1样本：用培养的K562细胞（慢性髓原白血病细胞）的基因组总RNA作为标准 品用于本方法的建立，临床样本采用抗凝外周血或骨髓0. 2-1. Oml。
[0026] 1. 2基因组总RNA提取：利用商品化的RNA提取试剂盒（购自北京天恩泽生物技 术有限公司，型号为3701-50)抽提总RNA，室温操作。
[0027] 抽提总RNA具体操作步骤：
[0028] (1)将0· 2-1. 5mL抗凝全血13000g离心3分钟，弃上清；
[0029] (2)将ImL溶液A加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解；
[0030] (3)将〇· 3mL的溶液B和0· 2mL氯仿加入离心管，剧烈震荡30秒，13000g离心5 分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；
[0031] (4)加入0· 5mL的溶液C和0· 2mL的氯仿到上清液中，剧烈摇晃30秒，13000g室 温离心3分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；
[0032] (5)在上清液中加入体积为其1/2的溶液D，剧烈摇晃30秒，13000g离心5分钟， 移弃上清液；
[0033] (6)在离心管中加入ImL体积分数为75%的乙醇，振荡器上振荡混均30秒，离心 13000g 1分钟，吸弃上清液；
[0034] (7)室温放置2分钟，加入10-30 μ L无 RNase水使RNA沉淀溶解，即为总RNA。
[0035] 1.3引物设计及筛选
[0036] 根据 BCR-ABL 融合基因 mRNA 序列，利用 Primer Explorer V4 软件（https:// primerexplorer. jp)设计多组引物，每引物组包括4条，根据反应时间及特异性对不同引 物的反应进程和结果进行监测、筛选，确定反应快、特异性高的最佳引物。筛选到的引物序 列见表1。
[0037] 表1筛选到的BCR-ABL融合基因的环介导等温扩增检测方法的最佳引物名称与 序列
[0038]
【权利要求】
1. 一种BCR-ABL融合基因快速检测方法的引物，其特征在于，包括：引物P1，其核苷酸 序列如SEQ ID N0:1所示；引物P2,其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；引物P3,其核苷酸 序列如SEQ ID NO :3所示；引物P4,其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
2. -种BCR-ABL融合基因快速检测方法的试剂盒，其特征在于，内含LAMP反应液、 阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0. 04 ii mol/ ii L的pH 8. 8的Tris-HCl， 0? 02iimol/ii L 的 KC1，0. 016iimol/ii L 的 MgS04,0 . 02iimol/ii L 的（HN4)2S04,0 . 00 2ii 1/ ii L 的 Tween2(l，1. 6 y mol/ y L 的甜菜喊，0? 0028 y mol/ y L 的 X 4 种 dNTPs，10U/ y L 的逆转 录酶，8"1^的88七0嫩聚合酶，0.0000511111〇1/1^的钙黄绿素，1.6?111〇1/1^的引物？1， 1. 6pmol/ii L 的引物 P2,0. 2pmol/ii L 的引物 P3,0. 2pmol/ii L 的引物 P4 ; 所述阳性对照为：反应时在反应液中加入BCR-ABL基因表达阳性的K562细胞基因组 RNA ;阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，LAMP反应液为lml、阳性对照50 ii L、阴性 对照lml。
4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包括：反应管50个， 1-10 iiL移液器头100个。
5. 如权利要求2-4任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，取20 y L反应液置于反 应管中，将5 ii L待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管 置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60_65°C水浴恒温反应40-45min,观察颜色变化。
6. 如权利要求5所述的使用方法，其特征在于，初次使用本试剂盒时设置阴性对照和 阳性对照。
【文档编号】C12Q1/68GK104328213SQ201410682584
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】杨炜华, 汪运山 申请人:济南市中心医院