反转录pcr检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法，本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述6-FAM探针具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述LCRed640探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。本发明所建立的反转录PCR体系可以有效的扩增RNA，即可以快速、有效地扩增临床样品中基孔肯雅病毒RNA核酸。
【专利说明】反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物科学【技术领域】，具体涉及反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒 及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 基孔肯雅热化ikungunya fever, CHIK是由基孔肯雅病毒化ikungunya virus, CHIKV引起，W伊蚊即埃及伊蚊Aedes aegypti，白纹伊蚊Aedes a化opicUis，非洲伊蚊 Aedes a化icana等吸血昆虫为主要传播媒介，W发热、皮疹及剧烈关节疼痛为主要临床症 状的急性病毒性虫媒传染病，潜伏期3-12天。主要流行于非洲和东南亚地区，但近年来在 东非海岸、印度洋岛鸣、美洲及加勒比海地区岛鸣流行，且流行地区呈现不断扩大的趋势， 发病数也不断上升。目前我国主要是输入性感染病例，但已有学者从人血清和猪、鼠等血 清中检测到基孔肯雅病毒抗体并分离到病原体。主要流行于非洲和东南亚地区，但近年来 流行地区呈现不断扩大的趋势，发病数也不断上升。而且在2010年10月，广东省东堯市 发生了我国首起基孔肯雅热社区聚集性疫情。CHIKV属于披膜病毒科Togaviridae甲病毒 属Alphavirus，通过病毒E1基因的系统发生分析可将CHIKV分为4个基因型；基孔肯雅病 毒西非基因型化ikungunya virus West African genotype,CHIKV-WA,基孔肯雅病毒亚洲 基因型Qiikungunya virus Asian genotype, CHIKV-Asian,基孔肯雅病毒印度洋基因型 Qiikungunya virus Indian Ocean genotype, CHIKV-IO,基孔肯雅病毒东 / 中 / 南非基因 M Chikungunya virus East/Central/South African genotype, CHIKV-ECSA。但近年来， 随着全球化进程的加快及全球变暖的加剧为该病由流行地区向非流行地区的传播创造了 条件；同时，由于基孔肯雅热与登革热和拒疾的临床症状相似且传播媒介雷同，使得很多基 孔肯雅热被误诊为登革热。
[0003] 目前基孔肯雅病毒的检测方法主要有；（1)病毒分离培养。本病毒可W在C6/36、 BHK-21、Verona、化la细胞和原代鼠肾细胞等细胞系W及乳鼠、蚊子等动物中增殖，病毒分 离培养具有灵敏度高、特异性强等优点，但同时对培养环境、人员、培养条件和仪器设备要 求较高；
[0004] (2)血清学方法。W免疫层析、免疫英光和化ISA为主的血清学方法是目前实验室 诊断和商业化试剂盒应用最广泛的方法，血清学检测是目前应用最广泛的方法，但抗体一 般会在机体感染病毒5天后产生W及不同基因型的基孔肯雅病毒及基孔肯雅病毒与其他 与之相近的病原体之间的交叉反应，使得本方法对基孔肯雅热集中爆发时的检测和确诊比 较困难；
[0005] (3)分子生物学方法。W反转录PCR，其是实时英光RT-PCR为主的分子生物学方 法为基孔肯雅病毒感染的诊断、预防和控制提供了快速、准确的诊断方法。但目前的实时英 光RT-PCR检测方法仍不能实时、特异和灵敏地检测所有基因型的基孔肯雅病。
[0006] (1)病毒分离。CHIKV能在C6/36、BHK-21、Verona、Hela细胞和原代鼠肾细胞中 增殖，可产生典型的细胞病变，并可产生蚀斑；用上述细胞分离病毒与用乳鼠分离病毒同样 敏感。可在乳鼠、某些脊椎动物细胞和蚊子中增殖，病毒分离方法包括乳鼠脑内接种、脊椎 动物细胞培养、蚊子细胞培养等，最常用的方法是细胞接种培养法。
[0007] 似血清学检测。血清学检测的时间范围较广，既可对机体内抗原进行检测，也可 对抗体进行检测。CHIKV感染并出现临床症状后3-6天，在病人血清中能检测到IgM和IgG 抗体。目前，CHIKV抗原血清学检测方法研究较少，抗体检测方法较多。主要包括免疫层析 法、免疫英光法、酶联免疫吸附法化ISA、血凝抑制法、病毒中和试验等。
[000引 （a)免疫层析法。当足够量的样本加入到检测卡样品孔后，样本中的CHIKV抗体会 结合到CHIKV抗原结合物上，并被膜上包被的抗抗体捕捉。目前已有商品化的检巧IJ试剂盒。 本方法操作简单，不需要大型仪器设备，适合检测一线及基层医疗单位开展该病的初选，但 该方法灵敏度和特异性较低，其检测阳性病例需通过其他方法进一步确诊。
[0009] 化）免疫英光法。又称英光抗体法，是一种将抗原、抗体的结合反应与形态学相结 合的方法。该方法集血清学反应的特异性、英光色素的敏感性和显微镜检法于一体，扩大了 免疫学诊断的效果，是近代免疫学的一种重要研究手段，且目前已经有商业化试剂盒。该 方法灵敏度较高，目前在CHIK疫情恢复性调查等领域应用较广泛，但对实验者的经验要求 高，需防止假阳性的诊断结果，且需要英光显微镜等精密仪器。
[0010] (C)血凝抑巧喊验。当PH和温度控巧化适当的条件时，CHIKV能使错的红细胞发生 凝集，而在特异性抗体存在的条件下，由于抗体与病毒抗原相结合，因而凝集现象被抑制。 本方法具有特异性强、敏感度高W及操作简便的优点，而且不需要特殊设备，但同时假阳性 的发生几率也很高。
[0011] (d)中和试验。该方法特异性较高，可用抗体交叉反应或特异性单克隆抗体进行试 验，可W与同群的其他病毒进行鉴别。本方法属于CHIK确诊试验，但需要CHIKV活病毒，试 验操作具有一定的危险性，且目前我国规定CHIKV培养需要在BSk3实验室内进行，因此 限制了该方法的应用。
[0012] (e化LISA法。可利用间接IgG ELISA法检测病例血清中的IgG抗体，及样品血清 中的IgG抗体可W与化ISA板上包被的CHIKV抗原结合，当加入显色剂后并通过读取其0D 值的方法判断样品为阴性或阳性。本方法已经有商业化的试剂盒，且操作简单，对仪器没有 特殊要求，但此方法检测的基础是需要血清中的抗体水平达到检测水平，一般在病毒感染 机体后5天。
[0013] (3)分子生物学检测方法。分子生物学技术的进步为病原体的检测和特性分析提 供了快速、可靠的技术手段。相对于血清学检测，分子生物学检测是CHIKV理想的早期诊断 方法。该方法的所需的样本量极少，可在短时间内得到准确结果；同时可W检测到不同来源 的样本，病毒培养液、血液、蚊子标本均可利用分子生物学方法进行检测。
[0014] (a)等温基因扩增技术。该方法对祀基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有 链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使祀基因高效扩增。此方 法扩增效率高、操作简单，且实验过程中不需要大型精密仪器，但此方法的灵敏度较低，同 时对于种属较复杂的病原体选择保守区间设置4对引物会很困难。
[0015] (b) RT-PCR 即为 verse Transcription Polymerase Qiain Reaction, RT-PCR 技 术。PCR方法是一种灵敏、特异、快速、低污染的检测技术，尤其是实时英光RT-CPR。应用常 规的RT-PCR检测方法，一般在发病后4天内在多感染者血清中均可检测到病毒核酸；而应 用更灵敏的实时英光RT-PCR技术甚至在发病7天后仍可检测到病毒核酸。因此，对处于发 热期的可疑病例，首选的实验室检测方法为实时英光RT-PCR，而且可将PCR产物进行序列 测定，准确判定是否为CHIKV感染或者感染的是哪种基因型。
[0016] 基孔肯雅病毒属于披膜病毒科Togaviridae甲病毒属Alphavirus，而甲病毒属成 员众多，且分类及其复杂。目前为止，主要分为7个抗原性复合群antigenic complex。其 基因组为不分节段的正链RNA，含有5个结构蛋白，壳蛋白C，包膜蛋白El、E2、E3和服和4 个非机构蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4。其中包膜蛋白El对其抗原性和分类学有重要意 义，通过病毒E1基因的系统发生分析可将CHIKV分为4个基因型：基孔肯雅病毒西非基因 型化ikungunya virus West African genotype, CHIKV-WA,主要流行于西非、美洲及加勒 比海地区；基孔肯雅病毒亚洲基因型Qiikungunya virus Asian genotype, CHIKV-Asian, 主要流行于东南亚及南亚地区；基孔肯雅病毒印度洋基因型化ikungunya virus Indian Ocean genotype, CHIKV-IO,此基因型是最近流行并定义的基因型，主要流行于印度洋岛 鸣及印度；基孔肯雅病毒东/中/南非基因型化ikungunya virus East/Central/South A化ican genotype，CHIKV-ECSA，是四个基因型中流行最广泛的CHIKV,主要分布于非洲的 东部、中部和南部W及印度洋地区。基孔肯雅热首先发现于坦桑尼亚，主要流行于非洲和亚 洲的热带及亚热带地区。但近年来，随着全球化进程的加快及全球变暖的加剧为该病由流 行地区向非流行地区的传播创造了条件，在我国南部沿海省份每年都有输入性基孔肯雅热 病例，时刻威胁着我国沿海防线；同时，由于基孔肯雅热与登革热和拒疾的临床症状相似且 传播媒介雷同，使得很多基孔肯雅热被误诊为登革病毒感染。
[0017] 因此，建立基孔肯雅病毒的快速、准确检验检测方法，有利于了解基孔肯雅病毒的 生物学特性、临床诊断，并将其应用于基孔肯雅病毒感染的检测工作，对防止其传入我国具 有重要意义。
[0018] 目前，缺乏一种高度灵敏、特异、快速检测的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂 盒及其检测方法。
【发明内容】
[0019] 本发明的目的是提供一种高度灵敏、特异、快速检测的反转录PCR检测基孔肯雅 病毒的试剂盒及其检测方法。
[0020] 本发明的技术方案如下；本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试 剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为 6-FAM探针和LCRed640探针；
[0021] 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核巧酸序列；
[0022] 所述6-FAM探针具有SEQ ID No. 2的核巧酸序列；
[0023] 所述LCRed640探针具有SEQ ID No. 3的核巧酸序列；
[0024] 所述下游引物具有SEQ ID No. 4的核巧酸序列。
[00巧]进一步地，所述试剂盒包括；引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动 Taq酶、dNTP、FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
[0026] 进一步地，所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对DNA质粒 标准品模板进行扩增获得的扩增核巧酸片段插入PUC57载体构建而成的重组质粒。
[0027] 更进一步地，所述DM质粒标准品模板的浓度为lOOgene copies/y 1。
[0028] 本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的实时英光定量FRET-PCR 扩增检测体系，实时英光定量FRET-PCR扩增对象包括DM质粒标准品模板、PCR阴性对照；
[0029] 实时英光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20 y 1的扩增体系；10 y 1的样品DNA 模板或者定量DNA标准试剂、IxPCR缓冲液、1 y M上游引物、1 y M下游引物、0. 2 y M的6-FAM 探针、0. 2 y M的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200 y M dNTP。
[0030] 本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测 体系，反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照； [003。 反转录PCR扩增检测体系包括20 y 1的扩增体系包含；10 ill的样品RNA模板或 者定量RNA标准试剂、IxPCR缓冲液、1 y M上游引物、1 y M下游引物、0. 2 y M的6-FAM探针、 0. 2 y M的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200 y M dNTP、0. 14个单位的商业化反 转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
[003引本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述PCR扩增 设置反应条件包括；预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的英光获得循环、 1个持续英光获得的烙解循环和1个降温循环；预变性：lx2min@95C ;18个温度递减的高 严谨循环；6xlsec@95°C，12sec@70°C，8sec@72°C ;9xlsec@95°C，12sec@68°C，8sec@72°C ; 3xlsec@95°C, 12sec@66°C , 8sec@72°C;40 个欠严谨的英光获得循环；40xlsec@95°C , 8sec@ 56°C，30sec@67°C，and30sec@72°C;l 个烙解循环；lxlsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持续收 集英光；降温循环；lxlsec@38°C。
[0033] 本发明的一种所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述反 转录PCR扩增设置反应条件包括；反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严 谨的英光获得循环和1个降温循环；
[0034] 反转录；lx30min@55 °C ;预变性；lx2min@95 °C ; 18个温度递减的高严谨循 环；6xlsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C;9xlsec@95 °C，12sec@68 °C，8sec@72 °C; 3xlsec@95°C, 12sec@66°C , 8sec@72°C;40 个欠严谨的英光获得循环；40xlsec@95°C , 8sec@ 56°C，30sec@67°C，and30sec@72°C ;降温循环；lxlsec@38°C。
[00巧]本发明所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒在基孔肯雅热病中的应用。 [003引有益效果：本发明所建立的反转录PCR体系可W有效的扩增RNA，即可从陕速、有 效地扩增临床样品中基孔肯雅病毒RNA核酸，为基孔肯雅热爆发时的快速、准确地诊断大 批临床样品，并尽快地控制本病提供了坚实的基础。反转录PCR体系可W特异、稳定地扩 增所有基因型的基孔肯雅病毒。本发明还具有一种高度灵敏、特异、快速检测所有基孔肯雅 病毒基因型 CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-I0、CHIKV-WA 的方法体系。
[0037] 本发明具有如下优点：
[003引 （1)本发明可W特异性地检巧1|所有基孔肯雅病毒的基因型。本发明RT-PCR体系具 有极高的灵敏度。在病毒感染的早期或恢复期，机体内病毒的含量相对较低，该就需要灵敏 度、准确度更高的检测方法，从而能够及时、快速地诊断、监测和控制传染病，尤其像基孔肯 雅热该种急性传染病。常规RT-PCR检测方法，一般在发病后4天内在多数患者血清中均可 检测到病毒核酸；而应用更灵敏的实时英光RT-PCR技术甚至在发病7天仍可检测到病毒核 酸。因此对处于发热期的可疑CHIK感染病例，首选的实验室检测方法为实时英光RT-PCR， 而且反转录PCR产物可W进行核酸序列测定，准确判定是否为CHIKV感染。本发明实时英 光RT-PCR体系可W检测到单拷贝的质粒核酸，载有基孔肯雅病毒4种基因型DNA核酸的质 粒标准品，同时可W有效地扩增最低10-7禽流感病毒H1N1的RNA核酸，从鸡胚尿囊液中制 备的RNA核酸标准品。
[0039] (2)本发明操作便捷，适合于检测大量样本。基孔肯雅热目前是一种地方流行性传 染病，主要流行于非洲、东南亚、地中海地区和加勒比海地区，但随着全球化进程的加快及 全球变暖的加剧为该病由流行地区向非流行地区的传播创造了条件，该就迫切需要一种快 速、准确的检测方法更好地应用于边检，为防止该病的传入提供诊断学基础；同时，基孔肯 雅热作为一种急性传染病，其在流行地区的预防，尤其是爆发流行地区的诊断和控制尤其 重要。（3)本发明根据基孔肯雅病毒4种基因型核酸序列中保守区间建立了一种可W对所 有基孔肯雅病毒基因型进行检测的反转录PCR系统。首先从NCBI上获得所有基孔肯雅病 毒基因型W及与之同源性较高的其他相关病原体的全基因序列，并选择相对保守的区间设 计引物和探针，然后用该引物和探针对样品进行实时、特异、灵敏和快速地检测。
[0040] (4)本发明确保此系统不扩增其它非基孔肯雅病毒的微生物，尤其是与其同源性 相近的其他病原体，如马雅罗病毒Mayaro virus，MAYV、盖培病毒Gat址virus，GETV、阿尼 昂尼昂 O'nyong-nyong virus, 0NNV、西口利克森林病毒 SemUki Forest virus, SFV、委内 瑞拉马脑炎 Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV、东方马脑炎 Eastern equine ence地alitis virus,邸EV和辛德毕斯病毒Sindbis virus，SINV;W及与其临床表现相似 且传播媒介相同、经常被误诊的传染病，如登革热、拒疾等。本发明选择基孔肯雅病毒保守 区域作为目的片段设计引物和探针。总体的思路是：巧妙地设计RT-PCR的引物和探针，可 W特异地扩增所有基孔肯雅病毒基因型的核酸，如基孔肯雅病毒亚洲基因型CHIKV-Asian、 基孔肯雅病毒东/中/南非基因型CHIKV-ECSA、基孔肯雅病毒印度洋基因型CHIKV-I0、基 孔肯雅病毒西非基因型CHIKV-WA，从而快速的判断出阳性样品。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为本发明反转录PCR的上游引物的示意图；
[004引图2为本发明反转录PCR的6-FAM探针的示意图；
[004引 图3为本发明反转录PCR的LCRed640探针的示意图；
[0044] 图4为本发明反转录PCR的下游引物的示意图；
[0045] 图5为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的扩增曲线的示意图；
[0046] 图6为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的烙解曲线的示意图；
[0047] 图7为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的扩增曲线的示意图；
[0048] 图8为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的烙解曲线的示意图；
[0049] 图9为本发明基孔肯雅病毒10基因型的扩增曲线的示意图；
[0050] 图10为本发明基孔肯雅病毒10基因型的烙解曲线的示意图；
[005。 图11为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的扩增曲线的示意图；
[0052] 图12为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的烙解曲线的示意图；
[0053] 图13为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的扩增曲线的示意图；
[0054] 图14为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的烙解曲线的示意图；
[005引图15为本发明中反转录PCR体系的扩增曲线的示意图；
[0056] 图16为本发明中反转录PCR体系的烙解曲线的示意图；
[0057] 图17为本发明四种基孔肯雅病毒基因型琼脂糖凝胶电泳的示意图。
【具体实施方式】
[0058] 下面将通过附图和具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对 本发明保护范围的限定。
[0059] 实施例1
[0060] 本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和 FRET-PCR标准品，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探 针；
[006。 如图1至图4所示，图1为本发明反转录PCR的上游引物的示意图；反转录PCR上 游引物序列；5' -CGGCTTCTTCAATATGATGCAGATG-3'（2化P)。此引物序列与所有基因型的基 孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
[006引图2为本发明反转录PCR的6-FAM探针的示意图；反转录PCR的6-FAM探针序列： 5' -GACACAATGGCAGTCACAGGCAGT-6-FAM-3' (24bp)，此序列为图中获得序列的对称链核巧酸 序列。此FAM探针序列与CHIKV-I0基因型核酸序列有1个错配碱基，而与其他基因型的基 孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
[0063] 图3为本发明反转录PCR的LCRed640探针的示意图；反转录PCR的LCRed640探 针序列；5' -LCRed640-TACACCGCCTGGARATACTTTTGTGGT-磯酸基团-3'（27bp)，此序列为图 中获得序列的对称链核巧酸序列。此下游引物序列中有1个兼并碱基R，此兼并碱基R可 W同时扩增A和G碱基。因此，此LCRed640探针序列与CHIKV-WA基因型核酸序列有1个 错配碱基，而与其他基因型的基孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
[0064] 图4为本发明反转录PCR的下游引物的示意图；反转录PCR下游引物序列；5'-GC ATTTTGCCTTCGTAATGCAACGA-3'（25bp)，此序列为图中获得序列的对称链核巧酸序列。此引 物序列和所有基因型的基孔肯雅病毒核酸序列完全吻合。
[0065] 基孔肯雅病毒反转录PCR检测方法所用引物和探针的核巧酸序列如下：
[0066] 上游引物；5, -CGGCTTCTTCAATATGATGCAGATG-3,沈Q ID No. 1 ;
[0067] 6-FAM 探针；5, -GACACAATGGCAGTCACAGGCAGT-6-FAM-3,沈Q ID No. 2 ;
[0068] LCRed640 探针：5, -LCRed640-TACACCGCCTGGARATACTTTTGTGGT-磯酸基团-3, SEQ ID No. 3 ；
[0069] 下游引物；5, -GCATTTTGCCTTCGTAATGCAACGA-3,沈Q ID No. 4。
[0070] 所述试剂盒包括；引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、 dNTP、FRET-PCR标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
[0071] 所述FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对DNA质粒标准品模板 进行扩增获得的扩增核巧酸片段插入PUC57载体构建而成的重组质粒。
[0072] 所述DNA质粒标准品模板的浓度为lOOgene copies/ y 1。
[0073] 本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的实时英光定量FRET-PCR 扩增检测体系，实时英光定量FRET-PCR扩增对象包括DM质粒标准品模板、PCR阴性对照；
[0074] 实时英光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20 y 1的扩增体系；10 y 1的样品DM 模板或者定量DM标准试剂、IxPCR缓冲液、1 y M上游引物、1 y M下游引物、0. 2 y M的6-FAM 探针、0. 2 y M的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200 y M dNTP。
[0075] 本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测 体系，反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照；
[0076] 实时英光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20 y 1的扩增体系；10 y 1的样品DNA 模板或者定量DNA标准试剂、IxPCR缓冲液、1 y M上游引物、1 y M下游引物、0. 2 y M的6-FAM 探针、0. 2 y M的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200 y M dNTP。
[0077] 本发明提供了一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的PCR扩增体系，所述 反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照；
[007引所述反转录PCR扩增检测体系包括20y 1的扩增体系包含；lOy 1的样品RNA模板 或者定量RNA标准试剂、IxPCR缓冲液、1 y M上游引物、1 y M下游引物、0. 2 y M的6-FAM探 针、0. 2uM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200UM dNTP、0. 14个单位的商业化 反转录酶、20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
[0079] 本发明的一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述PCR扩增 设置反应条件包括；预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的英光获得循环、 1个持续英光获得的烙解循环和1个降温循环；预变性：lx2min@95C ;18个温度递减的高 严谨循环；6xlsec@95°C，12sec@70°C，8sec@72°C ;9xlsec@95°C，12sec@68°C，8sec@72°C ; 3xlsec@95°C, 12sec@66°C , 8sec@72°C;40 个欠严谨的英光获得循环；40xlsec@95°C , 8sec@ 56°C，30sec@67°C，and30sec@72°C;l 个烙解循环；lxlsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持续收 集英光；降温循环；lxlsec@38°C。
[0080] 本发明的一种所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，所述反 转录PCR扩增设置反应条件包括；反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严 谨的英光获得循环和1个降温循环；
[0081] 反转录；lx30min@55 °C ;预变性；lx2min@95 °C ; 18个温度递减的高严谨循 环；6xlsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C;9xlsec@95 °C，12sec@68 °C，8sec@72 °C; 3xlsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C;40 个欠严谨的英光获得循环；40xlsec@95°C，8sec @56°C，30sec@67°C，and30sec@72°C ;降温循环；lxlsec@38°C。
[0082] 本发明所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒在基孔肯雅热病中的应用。
[0083] 从GenBank(www. ncbi. nlm. nih. gov)获取如下基孔肯雅病毒4个基因型和其他与 其同源性较高的种属的全基因序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法 对所有序列进行比对。
[0084] 图5为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的扩增曲线的示意图康明本发明系统 可W检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒Asian基因型DNA分子，且具有可重复性；
[0085] 图6为本发明基孔肯雅病毒Asian基因型的烙解曲线的示意图；本发明系统对于 基孔肯雅病毒Asian基因型具有稳定的Tm值。
[0086] 图7为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的扩增曲线的示意图康明本发明系统可 W检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒ECSA基因型DNA分子，且具有可重复性；
[0087] 图8为本发明基孔肯雅病毒ECSA基因型的烙解曲线的示意图康明本发明系统对 于基孔肯雅病毒ECSA基因型具有稳定的Tm值。
[008引图9为本发明基孔肯雅病毒10基因型的扩增曲线的示意图；表明本发明系统可W 检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒10基因型DNA分子，且具有可重复性；
[0089] 图10为本发明基孔肯雅病毒10基因型的烙解曲线的示意图康明本发明系统对 于基孔肯雅病毒10基因型具有稳定的Tm值。
[0090] 图11为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的扩增曲线的示意图康明本发明系统可 W检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒WA基因型DNA分子，且具有可重复性；
[00川图12为本发明基孔肯雅病毒WA基因型的烙解曲线的示意图康明本发明系统对 于基孔肯雅病毒WA基因型具有稳定的Tm值。
[0092] 图13为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的扩增曲线的示意图康明本发明 系统可W检测到反应体系中单拷贝的基孔肯雅病毒Asian、ECSA、10和WA基因型DNA分子， 且具有可重复性；
[0093] 图14为本发明四种基孔肯雅病毒基因型质粒的烙解曲线的示意图；表明本发明 系统对于基孔肯雅病毒Asian、ECSA、10和WA基因型具有稳定的Tm值。
[0094] 如图5至图9所示，本发明检测载有基孔肯雅病毒4个基因型（CHIKV-Asian、 CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)DNA序列的四种质粒（金斯瑞生物科技，中国南京）标准 品。结果表明，本发明系统可W特异、高效的扩增所有血清型的基孔肯雅病毒DNA;
[0095] 如图6至图14所示，本发明依据基孔肯雅病毒各基因型中保守区间巧妙地设计一 对引物和探针，可W同时检测到所有4种基孔肯雅病毒基因型（CIKV-Asian、CHIKV-ECSA、 CHIKV-I0、CHIKV-WA)
[009引图15为本发明中反转录PCR体系的扩增曲线的示意图；将从鸡胚尿囊液中提取的 流感病毒化1NDRNA进行梯度稀释，并用本发明RT-PCR反应条件和流感病毒引物和探针检 巧IJ。结果表明本发明中的反转录PCR体系可W检测到最低10-7拷贝的目的RNA核酸，且具 有可重复性；
[0097] 图16为本发明中反转录PCR体系的烙解曲线的示意图；所有稀释梯度表现出稳定 的烙解曲线。
[0098] 图17为本发明四种基孔肯雅病毒基因型琼脂糖凝胶电泳的示意图。本发明 RT-PCR体系扩增四种基孔肯雅病毒基因型（Asian、ECSA、10和WA)DNA的目的核巧酸片段 大小为139个碱基对化P)。各泳道依次为：泳道-1 ;标准品（Ladder)，泳道-2 ;基孔肯雅 病毒亚洲基因型（Qiikungunya virus Asian genotype，CHIKV-Asian),泳道-3;基孔肯雅 病毒东 / 中 / 南非基因型（Chikungunya virus East/Central/South African genotype, CHIKV-ECSA),泳道-4;基孔肯雅病毒西非基因型（Qiikungunya virus West African genotype CHIKV-WA),泳道-5;基孔肯雅病毒印度洋基因型（Qiikungunya virus Indian Ocean genotype，CHIKV-IO),泳道-6 ;阴性对照（NC)。其中，标准品（Ladder)各条带大小 依次为 20bp, 40bp，60bp, 80bp，lOObp, 120bp, 140bp，160bp，180bp，200bp 和 300bp。阳性样 品和阳性对照PCR的英光扩增曲线在640nm有英光的出现或增强，且PCR产物在琼脂糖凝 胶电泳中的条带大小为139bp。
[0099] 本发明反转录PCR特异性的确定：
[0100] 本发明的特异性从H个方面得到保证：
[0101] (1)设计的引物和探针经过GenBank的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特 异地扩增所有的基孔肯雅病毒基因型（CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)，而 不扩增其它非基孔肯雅热病原体尤其是与其同源性相近（马雅罗病毒、盖培病毒、阿尼昂 尼昂、西口利克森林病毒、委内瑞拉马脑炎、东方马脑炎和辛德毕斯病毒等）或临床特征相 似（登革热等）的病原体核酸。通过BLAST确认，本发明RT-PCR的探针和引物可W特异 地扩增和检测所有基孔肯雅病毒的核酸但不扩增其他相关病毒的核酸；
[0102] (2)如图6至图14所示，本发明检测载有基孔肯雅病毒4个基因型（CHIKV-Asian、 CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)DNA序列的四种质粒（金斯瑞生物科技，中国南京）标准 品。结果表明，本发明系统可W特异、高效的扩增所有血清型的基孔肯雅病毒DNA ;
[0103] (3)如图6至图14,图17所示，观察W上扩增对象在PCR过程中英光强度化40nm) 的变化，W及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。结果显示，所有基孔肯雅病毒 的质粒核酸的PCR扩增曲线的英光曲线在640nm波长处出现或增强；同时PCR扩增产物在 琼脂糖凝胶电泳中，显示139碱基对化P)的条带大小；
[0104] 本发明RT-PCR检测基孔肯雅病毒灵敏度的确定：
[0105] 如图6至图14所示，由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中国南京）合成基孔肯雅病毒 4 个基因型（CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-IO、CHIKV-WA)目的片段的 DNA 序列。依据 合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行 稀释，制备每10 y 1合成物的稀释试剂含10, 000拷贝、1，000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷 贝的基因。用本发明系统扩增含不同基因浓度的稀释液，来确定本发明检测此基因的灵敏 度。结果显示，此发明可W在反应系统中扩增单拷贝的目的基因。
[0106] 本发明中反转录PCR体系效率的确定：
[0107] 如图15和图16所示，用禽流感病毒H1N1感染鸡胚后收取鸡胚尿囊液，用商业化 RNA提取试剂盒（化曲Pure RNA Isolation Kit,罗氏，德国）从尿囊液中提取RNA，然后对 其进行梯度稀释，选取10-3-10-8进行反转录PCR扩增。结果表明，本发明的反转录PCR体 系可W检测到反应体系中最低为10-7拷贝的禽流感病毒RNA分子。
[0108] 制备PCR用的标准定量试剂：
[0109] (l)DNA质粒标准品的制备
[0110] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中国南京）合成基孔肯雅病毒4个基因型 (CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-I0、CHIKV-WA)目的片段的 DNA 序列。依据合成物的分 子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备 每10 y 1合成物的稀释试剂含10, 000拷贝、1，000拷贝、100拷贝、10拷贝、1拷贝的目的基 因作为标准品。本发明试剂盒中提供基孔肯雅病毒4个基因型、浓度为104/y 1的质粒标 准品。 。…]似RNA标准品的制备
[0112] 用禽流感病毒H1N1感染鸡胚后收取其尿囊液，用商业RNA提取试剂盒化i曲 Pure RNA Isolation Kit,罗氏，德国）进行RNA核酸提取后，用TE缓冲液，PH为8. 0进行 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8梯度稀释后作为检测反转录PCR系统效率的标准品。
[011引琼脂糖凝胶电泳：
[0114] 配制3 %琼脂糖凝胶，取10 y 1 PCR扩增产物，并用SYBR? Safe DNA Gel Stain(SYBR电 Safe DM Gel Stain, invitrogenTM by 1 ife technologies?，美国）染色， 在紫外灯下观察，可W看到139bp处的目的条带（图11)。所使用的标准品为20bp DM Ladder(Thermo Scientific O'RangeRuler 20bp DNA Ladder, ready-to-use, Fermentas? by Thermo Scientific?,美国）]，且其条带大小依次为 20bp，40bp，60bp，80bp，lOObp, 120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，300bp。
[01巧]PCR结果的判定：
[0116] 如图6至图14所示，实时英光PCR扩增对象包括DNA质粒标准品模板、PCR阴性 对照（双蒸水）；反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR 阴性对照（双蒸水）。此发明有着高度的特异性，可W检测到所有基孔肯雅病毒基因型 (CHIKV-Asian、CHIKV-ECSA、CHIKV-I0、CHIKV-WA)的核酸。
[0117] 实施例2
[0118] 转录方法验证本发明PCR体系：
[0119] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中国南京）合成含有基孔肯雅病毒亚洲基因型 CHIKV-Asian目的片段DNA和T7启动子的质粒批pU巧7,用合适的限制性内切酶（Sac I， 宝生物，大连）对质粒进行酶切；通过PCR扩增提高目的DM浓度；用商业化转录试剂盒 (MEGAscript?Kit，a血ion?bylifetechnologes?，美国）对PCR扩增产物进行转录并获 得RNA产物；转录完成后，将转录产物稀释后用于反转录PCR进行扩增。
[0120] (1)质粒的稀释
[0121] 将含有合成质粒的微型离也管4000转离也2分钟，然后加入40 y 1 TE缓冲液，PH 为8. 0配成质粒浓度为10化g/ y 1的溶液；
[0122] (2)质粒的酶切
[0123] 用商业化限制性内切酶SacI (Sac I，宝生物，大连）对质粒进行酶切，其反应体系 为20 y 1，且各试剂成分组成如下表；将各反应液混合后放入37C环境中赔育1个小时；然 后将反应体系混合液放入56C环境中加热20分钟使限制性内切酶失火，从而终止酶切反 应；
[0124]
【权利要求】
1. 一种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，包括引物、探针和FRET-PCR标准品，其 特征在于：所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针； 所述上游引物具有SEQIDNo. 1的核苷酸序列； 所述6-FAM探针具有SEQIDNo. 2的核苷酸序列； 所述LCRed640探针具有SEQIDNo. 3的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQIDNo. 4的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于：所述 试剂盒包括：引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、FRET-PCR 标准品、PCR阴性对照；所述PCR阴性对照为双蒸水。
3. 根据权利要求2所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于：所述 FRET-PCR标准品是由所述的FRET-PCR的引物和探针对DNA质粒标准品模板进行扩增获得 的扩增核苷酸片段插入PUC57载体构建而成的重组质粒。
4. 根据权利要求3所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征在于：所述 DNA质粒标准品模板的浓度为lOOgenecopies/ii1。
5. -种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体 系，其特征在于：实时荧光定量FRET-PCR扩增对象包括DNA质粒标准品模板、PCR阴性对 昭. >、、、? 实时荧光定量FRET-PCR扩增检测体系包括20yl的扩增体系：10yl的样品DNA模板 或者定量DNA标准试剂、lxPCR缓冲液、1iiM上游引物、1iiM下游引物、0. 2iiM的6-FAM探 针、0. 2iiM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200iiMdNTP。
6. -种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的反转录PCR扩增检测体系，其特征在 于：反转录PCR扩增对象包括RNA标准品模板、RNA提取的阴性对照和RT-PCR阴性对照； 反转录PCR扩增检测体系包括20iU的扩增体系包含：10ia的样品RNA模板或者定量RNA标准试剂、lxPCR缓冲液、1iiM上游引物、1iiM下游引物、0. 2iiM的6-FAM探针、0. 2iiM 的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200iiMdNTP、0. 14个单位的商业化反转录酶、 20个单位的商业化RNA酶抑制剂。
7. -种反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述 PCR扩增设置反应条件包括：预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧 光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；预变性：lx2min@95°C; 18 个温度递减的高严谨循环：6xlsec@95°C，12sec@70°C，8sec@72°C;9xlsec@95°C， 12sec@68°C，8sec@72°C;3xlsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C;40 个欠严谨的荧光获 得循环：40xlsec@95°C，8sec@56°C，30sec@67°C，and30sec@72°C;1 个熔解循环：lx lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持续收集荧光；降温循环：lxlsec@38°C。
8. -种所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述 反转录PCR扩增设置反应条件包括：反转录、预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠 严谨的荧光获得循环和1个降温循环； 反转录：lx30min@55°C;预变性：lx2min@95°C;18个温度递减的高严谨循 环：6xlsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72°C;9xlsec@95 °C，12sec@68 °C，8sec@72°C; 3xlsec@95 °C，12sec@66 °C，8sec@72°C;40 个欠严谨的荧光获得循环：40x lsec@95°C，8sec@56°C，30sec@67°C，and30sec@72°C;降温循环：lxlsec@38°C。
9.权利要求1-4任一项所述的反转录PCR检测基孔肯雅病毒的试剂盒在基孔肯雅热病 中的应用。
【文档编号】C12R1/93GK104513865SQ201410690212
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】王成明, 张继垒, 陆光武, 成大荣 申请人:扬州大学