一种万古霉素的补料培养基及生产万古霉素的方法
【专利摘要】本发明提供一种可提高万古霉素产量的万古霉素的补料培养基及生产万古霉素的方法，所述补料培养基包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种，所述碳源包括甘油、淀粉、燕麦粉、葡萄糖、乳糖、淀粉中的一种或几种，所述氮源包括黄豆粉、棉籽精粉、玉米蛋白粉中的一种或几种，所述PH调节剂包括磷酸和氨水中的一种或两种；所述方法包括在发酵过程中向发酵培养基添加补料培养基，所述补料培养基包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种。本发明的有益效果在于，发酵过程中向发酵培养基中添加所述补料培养基，降低抑制产生万古霉素次生代谢途径的因素，可提高万古霉素发酵的产量。
【专利说明】一种万古霉素的补料培养基及生产万古霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗生素发酵领域，具体地说是一种万古霉素的补料培养基及生产万古 霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 万古霉素是东方诺卡氏菌在控制发酵条件下产生的一种两性糖肽类抗生素，其化 学式为C 66H75C12N9O24，分子量为1486。现有技术中可通过微生物Amycolatopis orientalis 发酵制备万古霉素。万古霉素是目前治疗盘尼西林耐药菌感染者和β-内酰胺类抗生素过 敏症的首选药，被国际抗生素专家誉为"人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线"。万古 霉素作为一种疗效独特的抗生素在临床应用上具有日益重要的地位。
[0003] 万古霉素是发酵产生的次生代谢产物，特点是一般不在细胞迅速生长期产生，而 是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段，负责次级代谢产物合成的酶处于 抑制状态，因而不产生万古霉素，一旦生长接近尾声，这些酶便开始被激活或被合成，开始 合成万古霉素。影响次级代谢产物的因素非常复杂，例如葡萄糖效应和毒蛋白效应都会抑 制万古霉素的产量，筛选更加合适的培养条件和培养基组分等，提高万古霉素的产量是企 业不断追求的。在我国，万古霉素虽已实现国内的产业化生产，但发酵的产量仍有待提高。
[0004] 补料发酵虽然在发酵行业广泛使用，但是由于产品的差异导致菌种不同，或者即 使同菌株经过不同的公司筛选程序后选育出的菌株特性也会产生差异，菌种或菌株的差异 导致发酵生产过程中，各生产条件如通气量、碳源、氮源、发酵时间等的差异，不同产品或者 不同公司的补料发酵工艺在推广的过程中存在众多技术难题。基于这些原因，使得即使补 料发酵在青霉素或者维生素发酵行业已经应用，在万古霉素发酵生产中并没有公开成功的 案例。
[0005] 对于万古霉素补料发酵，以下问题亟需得到解决：补料的时机（发酵物料发酵到 什么程度补）、补料过程如何防染菌、补料的比例（所补营养成分占发酵液的百分之几）等。 补料时机的选择尤为重要，需要能够降低葡萄糖效应的同时保证碳源的供应；另外还需确 定添加的营养成分种类、各营养成分各自的补料时机、补料的比例等。众多技术问题给万古 霉素补料发酵带来障碍。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种可提高万古霉素产量的万古霉素补料培 养基及生产万古霉素的方法。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种万古霉素的补料培养基， 包括碳源、氮源和PH调节剂中的一种或几种，所述碳源包括甘油、淀粉、燕麦粉、葡萄糖、乳 糖、淀粉中的一种或几种，所述氮源包括黄豆粉、棉籽精粉、玉米蛋白粉中的一种或几种，所 述PH调节剂包括磷酸和氨水中的一种或两种。
[0008] 本发明的另一技术方案为：一种生产万古霉素的方法，包括在发酵过程中向发酵 培养基添加补料培养基，所述补料培养基包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种。
[0009] 本发明的有益效果在于：发酵过程中用补料培养基向发酵培养基补料，降低抑制 产生万古霉素次生代谢途径的因素，可提高万古霉素发酵的产量。
【具体实施方式】
[0010] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
[0011] 本发明最关键的构思在于：在发酵过程中，通过向发酵培养基中添加补料培养基， 降低抑制产生万古霉素次生代谢途径的因素，提高万古霉素发酵的产量，即采用补料发酵 的途径，促进发酵过程中万古霉素的次生代谢途径，提高万古霉素发酵的产量。
[0012] 本发明提供一种万古霉素的补料培养基，包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或 几种，所述碳源包括甘油、淀粉、燕麦粉、葡萄糖、乳糖、淀粉中的一种或几种，所述氮源包括 黄豆粉、棉籽精粉、玉米蛋白粉中的一种或几种，所述PH调节剂包括磷酸和氨水中的一种 或两种。
[0013] 进一步的，包括碳源、氮源和pH调节剂，所述碳源包括甘油和淀粉，所述碳源中甘 油和淀粉的体积与质量之比V:w为0. 5mL: lg-0. 65mL: Ig ;所述氮源包括黄豆粉和玉米蛋白 粉，所述氮源中黄豆粉和玉米蛋白粉的质量比w:w为1:0.8到1:1 ;所述pH调节剂包括磷 酸和氨水中的一种或两种。
[0014] 本发明还提供一种生产万古霉素的方法，包括在发酵过程中向发酵培养基添加补 料培养基，所述补料培养基包括碳源、氮源和PH调节剂中的一种或几种。
[0015] 进一步的，控制发酵培养基的pH值为6. 6-7. 4,向发酵培养基添加碳源以控制发 酵培养基还原糖的质量百分比浓度为〇. 5% -1. 5%，发酵IlOh后结束添加碳源，结束添加 碳源后当还原糖的质量百分比浓度降至0. 2%时结束发酵过程。
[0016] 进一步的，控制发酵培养基的pH值为6. 6-7. 4,向发酵培养基添加氮源以控制发 酵培养基的氨基氮的质量浓度为20-120g/L。
[0017] 进一步的，控制发酵培养基的pH值为6. 6-7. 4,向发酵培养基添加碳源以控制发 酵培养基还原糖的质量百分比浓度为〇. 5% -1. 5%，向发酵培养基添加氮源以控制发酵培 养基的氨基氮的质量浓度为20-120g/L，发酵IlOh后结束添加碳源，结束添加碳源后当还 原糖的质量百分比浓度降至〇. 2%时结束发酵过程。
[0018] 以下为本发明实施例，其中v:w表示体积（单位为mL):质量（单位为g), w:w表 示质量：质量；V: V表示体积：体积。
[0019] 实施例1(包括实施方案1、2、3、4和5)
[0020] 实施方案1
[0021] (1)种子培养：将东方拟无枝酸菌接种到种子培养基中，在30L试验罐进行培养， 培养周期为50±16h ;
[0022] 培养条件：温度30°C，通气量v:v 1:1，罐压(X04Mpa，转速300rpm，初始pH值 6. 8 ；
[0023] 种子培养基配方（质量比％ ):淀粉4. 0,黄豆粉2. 0,葡萄糖1. 5,酵母粉1. 0,氯 化钠0. 6,磷酸二氢钾0. 02。
[0024] (2)发酵培养：将培养好的种子液按接种量10 %接种到发酵培养基中，在50L试验 罐进行培养，培养周期为120±60h ;
[0025] 发酵培养基配方（质量比％ ):淀粉6.0,黄豆粉2.0,丝素粉0.5,硫酸铵0.2,磷 酸二氢钾0. 005,氯化镁0. 02,氯化钙0. 3。
[0026] 培养条件：温度 33.5°C，通气量 v:v 罐压 0.03_0.04Mpa，转速 300-500rpm，初始 pH 值 6. 8。
[0027] 实施方案2 :补加碳源，调控pH
[0028] 重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度和 PH值，当还原糖的质量百分比浓度高于1.0%时，添加碳源，至还原糖的质量百分比浓度为 0. 2%范围内；用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6. 6-7. 4。
[0029] 所述碳源为甘油、淀粉的混合物，混合比例（v:w)为0. 5:1。
[0030] 实施方案3 :补加氮源，调控pH
[0031] 重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的氨基氮的质量浓度和pH值，当 氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮源，至氨基氮的质量浓度至120g/L ;用磷酸或氨水 调节pH值，使得pH值保持在6. 6-7. 4。
[0032] 所述氮源为黄豆粉、玉米蛋白粉的混合物，混合比例（w:w)为1:1。
[0033] 实施方案4 :补加碳源、氮源，调控pH
[0034] 重复进行实施例1中实施方案1，检测发酵培养基的还原糖的质量百分比浓度、氨 基氮和PH值，当还原糖的质量百分比浓度为1.0%时，添加碳源，至120小时停止补料，至 还原糖的质量百分比浓度低于〇. 2%结束培养；当氨基氮的质量浓度低于20g/L时，添加氮 源，至氨基氮的质量浓度至120g/L ;用磷酸或氨水调节pH值，使得pH值保持在6. 6-7. 4。
[0035] 所述碳源为甘油、淀粉的混合物，混合比例（v:w)为0. 5:1。
[0036] 所述氮源为黄豆粉、玉米蛋白粉的混合物，混合比例（w:w)为1: 1。
[0037] 实施方案5:仅调控pH
[0038] 重复进行实施例1中实施方案1，用磷酸或氨水调节发酵培养基的pH值，使得pH 值保持在6. 6-7. 4。
[0039] 表1为实施方案1-5的万古霉素发酵情况。
[0040] 表 1
[0041]
【权利要求】
1. 一种万古霉素的补料培养基，其特征在于：包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或 几种，所述碳源包括甘油、淀粉、燕麦粉、葡萄糖、乳糖、淀粉中的一种或几种，所述氮源包括 黄豆粉、棉籽精粉、玉米蛋白粉中的一种或几种，所述PH调节剂包括磷酸和氨水中的一种 或两种。
2. 根据权利要求1所述的万古霉素的补料培养基，其特征在于：包括碳源、氮源和 pH调节剂，所述碳源包括甘油和淀粉，所述碳源中甘油和淀粉的体积与质量之比v:w为 0. 5mL:lg-0. 65mL:lg ;所述氮源包括黄豆粉和玉米蛋白粉，所述氮源中黄豆粉和玉米蛋白 粉的质量比w:w为1:0. 8到1:1 ;所述pH调节剂包括磷酸和氨水中的一种或两种。
3. -种生产万古霉素的方法，其特征在于：包括在发酵过程中向发酵培养基添加补料 培养基，所述补料培养基包括碳源、氮源和pH调节剂中的一种或几种。
4. 根据权利要求3所述的生产万古霉素的方法，其特征在于：控制发酵培养基的 pH值为6. 6-7. 4,向发酵培养基添加碳源以控制发酵培养基还原糖的质量百分比浓度为 0.5% -1.5%，发酵110h后结束添加碳源，结束添加碳源后当还原糖的质量百分比浓度降 至0.2%时结束发酵过程。
5. 根据权利要求3所述的生产万古霉素的方法，其特征在于：控制发酵培养基的pH值 为6. 6-7. 4,向发酵培养基添加氮源以控制发酵培养基的氨基氮的质量浓度为20-120g/L。
6. 根据权利要求3所述的生产万古霉素的方法，其特征在于：控制发酵培养基的 pH值为6. 6-7. 4,向发酵培养基添加碳源以控制发酵培养基还原糖的质量百分比浓度为 0. 5% -1. 5%，向发酵培养基添加氮源以控制发酵培养基的氨基氮的质量浓度为20-120g/ L，发酵110h后结束添加碳源，结束添加碳源后当还原糖的质量百分比浓度降至0. 2%时结 束发酵过程。
【文档编号】C12P21/02GK104404113SQ201410696241
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】鲁智林, 陈坚超, 石敏敏 申请人:丽珠集团福州福兴医药有限公司