检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物及其筛选方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明针对转基因作物，依据EGFP基因核苷酸序列开发设计强专化性引物，在EGFP基因上下游分别设计12个和13个引物，上下游引物共组合156对引物。通过3轮筛选出2对便于检测EGFP的引物EGFP1和EGFP2。利用EGFP1和EGFP2为引物扩增EGFP基因，其扩增片段大小分别为445bp和294bp。本发明针对EGFP基因所开发筛选的两对引物，可在转基因PCR检测中准确检测出可信的阳性转基因材料，具有重要的实用价值。
【专利说明】检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物及其筛选方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物 及其筛选方法与应用。
【背景技术】
[0002] 绿色突光蛋白（Green fluorescent protein, GFP)是一类存在于包括水母、水螅 和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，在紫外光或蓝光的激发下可发出绿色荧光，由于 该蛋白可活体检测且具有对细胞无毒害等优点，被广泛应用于生命科学多个领域，尤其在 分子生物学和细胞生物学中GFP基因是一个非常常用的报告基因。
[0003] 目前应用较多的GFP是增强型绿色突光蛋白（Enhanced Green fluorescent protein，EGFP)，其为GFP的突变体（64位苯丙氨酸突变为亮氨酸），所发射的荧光强度比 GFP大6倍以上。因此，EGFP较GFP而言更适合作为一种报告基因来研究基因的表达、细胞 的分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
[0004] 随着转基因技术的快速发展，全球转基因产品日益增多，转基因检测成为一个必 不可少且至关重要的工作。转基因检测对象主要基于外源基因（启动子、标记基因、报告基 因和目的基因等）的核苷酸序列和蛋白表达产物，检测方法中应用最广泛的是基于外源基 因核苷酸序列所建立的常规定性PCR(Polymerase Chain Reaction)检测。
[0005] 常规PCR方法作为分子生物学实验中的基础实验方法，具有操作简易、成本费用 低等优点。但作为转基因检测方法，常规PCR检测存在灵敏度低、容易产生交叉污染、假阳 性和假阴性比例偏高的缺点。以上问题的存在，很大程度上可能是由于检测引物不够特异。 本发明为解决转基因常规PCR检测中的常见问题，针对转基因作物依据EGFP基因序列开发 设计专化性引物156对，并通过3轮有目的针对性的筛选，选出2对在实验操作中可以准确 检测EGFP基因的引物。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在于克服现有技术的不足，提供了用于检测增强型绿色荧光蛋白基因 (EGFP)的引物，其筛选方法与应用为转基因外源基因检测引物的开发和筛选提供一定的科 学依据。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种检测增强型绿色荧光蛋白基 因的引物，其特征在于，所述引物为EGFP1或EGFP2 ;所述EGFP1的正向引物碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，EGFPl的反向引物碱基序列如SEQ ID NO:2所示；所述EGFP2的正向引物碱 基序列如SEQ ID N0:3所示，EGFP2的反向引物碱基序列如SEQ ID N0:4所示。
[0008] -种检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物的筛选方法，其特征在于，包括以下步 骤：
[0009] 步骤A :采用PrimeU软件设计检测EGFP基因的强专化性引物，在基因上游设计 12个引物，命名为gfpFn(n = 1，…，12);在基因下游设计13个引物，命名为gfpRm(m = 1，"·，13);上下游引物分别两两组合，共组合156(12X13)对引物；
[0010] 步骤B :利用Karroten质粒提取试剂盒提取EGFP的表达质粒，利用植物基因组 DNA提取试剂盒分别提取转基因作物叶片DNA和非转基因作物叶片DNA ;
[0011] 步骤C :引物筛选的方式分为3轮，每轮筛选设置重复实验一次，第1轮筛选：利用 无菌水作为模板进行PCR扩增，除去以无菌水为模板仍可扩增出条带的引物，筛选出64对 引物；第2轮筛选：利用第1轮筛选出的引物，以EGFP的表达质粒DNA和无菌水为模板进行 PCR扩增，选出能扩增出EGFP基因条带并且在无菌水中扩增不出条带的引物，筛选出16对 引物；第3轮筛选：利用第2轮筛选出的引物，以质粒DNA、转基因和非转基因作物DNA、无菌 水4种为模板进行PCR扩增，选出能在质粒及转基因作物中扩增出EGFP基因条带、在非转 基因作物及无菌水中扩增不出条带的引物，筛选出2对引物（EGFP1和EGFP2)。
[0012] 作为优选地，所述转基因作物为转基因玉米，非转基因作物为非转基因玉米。
[0013] 作为优选地，在所述步骤A中，检测EGFP的强专化性引物的设计条件：Tm值 (melting temperature)为 50°C?60°C，以 58°C最佳；GC 含量为 50%?70%，以 55%最 佳；引物长度为17bp?24bp，以20bp最佳。
[0014] 作为优选地，在所述步骤C中，PCR扩增反应体系：总反应体积为25. 0 μ 1，包括： 1. 〇 μ 1模板（除以无菌水为模板外，模板质粒DNA、转基因作物DNA和非转基因作物DNA浓 度均为20叩/4 1)，2.54 110\卩0?1311打61'，1.〇4 154 1]1〇1/1^?1'；[11161'，2.04 12.51111]1〇1/1^ dNTPs, 2. 0 μ 125mmol/L MgCl2, 0. 1 μ I 5U/ μ I rTaq, 16. 4 μ I ddH20〇
[0015] 作为优选地，在所述步骤C中，PCR扩增条件：94°C反应3min ;94°C反应40s，58°C 反应40s，72°C反应45s，重复38个循环；72°C反应5min。
[0016] 作为优选，在所述步骤C中，PCR扩增产物在质量体积分数2%的琼脂糖凝胶（含 溴化乙锭〇· 5 μ g/ml)上以80V电压电泳45min。
[0017] 以转基因作物DNA为模板，利用EGFPl引物扩增EGFP基因，其扩增片段为445bp， 或利用EGFP2引物扩增EGFP基因，其扩增片段为294bp，则待检材料为EGFP转基因阳性材 料。
[0018] 本发明针对EGFP基因所开发筛选的两对引物，可在转基因 PCR检测中准确检测出 可信的阳性转基因材料，具有重要的实用价值，并且检测引物开发和筛选方法为日后转基 因外源基因检测引物的设计提供一定科学依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为引物第一轮筛选电泳结果示意图（部分）；
[0020] 图2为引物第二轮筛选电泳结果示意图（部分），其中第奇数（1、3、···、21、23)泳 道为EGFP的表达质粒、其余泳道为无菌水；
[0021] 图3为引物第三轮筛选电泳结果示意图（部分），其中第1、2、3和4泳道分别为 EGFP的表达质粒、转基因玉米、非转基因玉米和无菌水。
【具体实施方式】
[0022] 以下以转基因玉米为例，对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限定本发明。 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，如Sambrook等分子克隆实验手 册（New York :Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或 Draper，J 等（1988)操 作技术规程或按照制造厂商所建议的实验条件。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊 说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0023] 所用 DNA Maker 为 TaKaRa 公司生产的 DL500,由 DNA 片段 500bp、400bp、300bp、 200bp、150bp、100bp、50bp 组成，共 7 条带。
[0024] 1、引物的开发
[0025] 利用 Primer3 软件（http://frodo. wi. mit. edu/primer3/)，依据 EGFP 基因核苷酸 序列（SEQ ID NO:5)开发设计强专化性引物，引物设计条件：Tm值（melting temperature) 设置为50°C?60°C，以58°C最佳；GC含量设置在50%?70%，以55%最佳；引物长度设置 在17bp?24bp，以20bp最佳。在基因上游设计12个引物，命名为gfpFn(n=l，…，12) (见表1);在基因下游设计13个引物，命名为gfpRm(m= 1，…，13)(见表2);上下游引物 分别两两组合，共组合156(12X13)对引物。
[0026] 表1用Primer3软件在EGFP基因上游设计的12个引物序列
[0027]
【权利要求】
1. 一种检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物，其特征在于，所述引物为EGFP1或 EGFP2 ;所述EGFP1的正向引物碱基序列如SEQ ID N0:1所示，EGFP1的反向引物碱基序列 如SEQ ID N0:2所示；所述EGFP2的正向引物碱基序列如SEQ ID N0:3所示，EGFP2的反向 引物碱基序列如SEQ ID N0:4所示。
2. -种筛选权利要求1所述引物的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤A :采用Primed软件设计检测EGFP的强专化性引物，在基因上游设计12个引物， 命名为gfpFn(n= 1，…，12);在基因下游设计13个引物，命名为gfpRm(m= 1，…，13);上 下游引物分别两两组合，共组合156对引物； 步骤B :利用Karroten质粒提取试剂盒提取EGFP的表达质粒，利用植物基因组DNA提 取试剂盒分别提取转基因作物叶片DNA和非转基因作物叶片DNA ; 步骤C :引物筛选的方式分为3轮，每轮筛选设置重复实验一次，第1轮筛选：利用无菌 水作为模板进行PCR扩增，除去以无菌水为模板仍可扩增出条带的引物；第2轮筛选：利用 第1轮筛选出的引物，以EGFP的表达质粒DNA和无菌水为模板进行PCR扩增，选出能扩增 出EGFP基因条带并且在无菌水中扩增不出条带的引物；第3轮筛选：利用第2轮筛选出的 引物，以质粒DNA、转基因和非转基因作物DNA、无菌水4种为模板进行PCR扩增，选出能在 质粒及转基因作物中扩增出EGFP基因条带、在非转基因作物及无菌水中扩增不出条带的 引物。
3. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转基因作物为转基因玉米，非转基因 作物为非转基因玉米。
4. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤A中，检测EGFP的强专化性引 物的设计条件：!'111值为501：?601：，6(：含量为50%?70%，引物长度为17&--2你？。
5. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤C中，PCR扩增反应体系： 总反应体积为 25. 0 iil，包括：1. 0 ill 模板，2. 5 ill lOXPCRbuffer, 1. 0 iil5 ii mol/L Primer, 2. 0 u 1 2. 5mmol/L dNTPs, 2. 0 u 1 25mmol/L MgCl2, 0. 1 u 1 5U/ u 1 rTaq, 16. 4 u 1 ddH20。
6. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤C中，PCR扩增条件：94°C反应 3min ;94°C反应 40s, 58°C反应 40s, 72°C反应 45s,重复 38 个循环；72°C反应 5min。
7. 按照权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤C中，PCR扩增产物在质量体 积分数2%的琼脂糖凝胶上以80V电压电泳45min。
8. 按照权利要求1所述一种检测增强型绿色荧光蛋白基因的引物的应用，其特征在 于，以转基因作物DNA为模板，利用EGFP1引物扩增EGFP基因，其扩增片段为445bp，或利用 EGFP2引物扩增EGFP基因，其扩增片段为294bp，则待检材料为EGFP转基因阳性材料。
【文档编号】C12N15/10GK104404148SQ201410696383
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】葛敏, 张晓林, 赵涵 申请人:江苏省农业科学院