一种恶疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3′；BIP：5′-AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3′；F3：5′-TTCTGCGCTAGGCGACC-3′；B3：5′-CACACAAGTGGACCGTTAG-3′；LB：5′-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为恶疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于恶疫霉菌的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，能够对田间土壤中的恶疫霉菌进行检测。本发明对恶疫霉菌引起的疫病防治和对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。
【专利说明】-种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂 盒和LAMP检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其 LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
【背景技术】
[0002] 恶疫霉（Phytophthora cactorum)侵染引起的植物疫病是一种世界性分布的 土传毁灭性病害，危害超过200种植物，常给多种经济作物（如草莓、苹果、梨、人参等） 的生产带来严重损失。恶疫霉菌属于卵菌门（Oomycota)、卵菌纲（Oomycetes)、霜霉目 (Peronosporales)、腐霉科（Pythiaceae)、疫霉属（Phytophthora)。恶疫霉引起的植物病 害分布广泛，所以建立恶疫霉的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意 义。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止 病原菌的传播和阻碍其扩散方式。
[0003] 传统的恶疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征 等。传统方法在恶疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业 的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、 易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害 发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供 了快速、灵敏、准确的优势。普通PCR的方法已经成功用于检测恶疫霉菌，虽然PCR法在特 异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4?5h，同时PCR方法依赖 精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
[0004] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种 新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新 的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的 作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有 畐IJ产物一白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域， 所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热 源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等 特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应 用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少， 恶疫霉菌的检测国内外均未见报道。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中恶疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异 性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物。本发 明的另一目的是提供上述恶疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明还有一目的是提供上述恶 疫霉菌的LAMP检测方法。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种用于检测恶疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物 BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：
[0008] FIP -TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3 / ；
[0009] BIPji -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3';
[0010] F3:5' -TTCTGCGCTAGGCGACCHV ;
[0011] B3 :5，-CACACAAGTGGACCGTTAG-3，；
[0012] LB:5，-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3，。
[0013] 所述的LAMP检测引物组合物在检测恶疫霉菌中的应用。
[0014] 一种检测恶疫霉菌的LAMP检测试剂盒：包含ImL检测溶液，所述的检测溶液包括： 32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环 引物 LB、50mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、0.24mM MgS04、4% Triton X_100、Bst DNA polymerase 320单位，200mM轻基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如下：
[0015] FIP -TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3 / ；
[0016] BIPiSi -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3/ ；
[0017] F3:5' -TTCTGCGCTAGGCGACCHV ;
[0018] B3:5，-CACACAAGTGGACCGTTAG-S，；
[0019] LB:5， -GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3，。
[0020] 所述的检测恶疫霉菌的LAMP试剂盒在检测恶疫霉菌中的应用。
[0021] 一种检测恶疫霉菌的LAMP检测方法：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA 为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存在恶疫 霉菌；无特征性阶梯状条带，则所检测样品中无恶疫霉菌；或观察LAMP反应溶液颜色变化， 天蓝色表示检测为阳性，存在恶疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在恶疫霉菌。
[0022] 所述的检测恶疫霉菌的LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取1 μ L DNA溶液， 加入23 μ LLAMP试剂盒中的检测溶液和1 μ L灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为： 60°C?65°C,50 ?70min。
[0023] 本发明的检测恶疫霉菌的方法，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模 板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP ;轻基萘酚蓝（hydroxylnaphthol blue，HNB)属 于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液PH变化而改变，因此可以 通过监测LAMP反应体系中Mg 2+浓度的变化及溶液PH而起到颜色指示剂的作用。反应前 将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg 2+与LAMP反应的副产物P2O广结合 产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。 因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断恶疫霉菌的有无：天蓝色表示检测为阳 性，存在恶疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在恶疫霉菌。
[0024] 本发明的关键性技术之一是恶疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。 为了验证恶疫霉菌的特异性引物序列，本发明以15株恶疫霉菌菌株和13种其它卵菌以及 19种病原真菌为供试材料（表1)，采用CTAB法提取发病组织中恶疫霉菌的DNA。具体方法 如下：取少量菌丝粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩涡混匀，于55°C水浴 lh，中间每IOmin上下颠倒几次。12000rpm离心lOmin，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇 (25 :24 :1)，颠倒混勻，12000rpm离心IOmin ;将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒 混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M 似八(：(?!15.2)，-201：沉淀（>111)。12000印111离心101^11，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两 次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE (pH 8.0)溶解沉淀（含20 μ g/mL RNase)，37°C处理 Ih后，-20°C保存备用。所有的土壤样品采用FastDNAli SPIN试剂盒（Q-Biogene Ltd, USA) 进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。这一商用土壤微生物DNA提取试 剂盒可以在〇. 5h内提取到土壤中的微生物。
[0025] 当发生LAMP扩增反应时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升， 通过HNB的显色反应结果所示，恶疫霉菌的反应管里均呈天蓝色，其为阳性结果，而其它疫 霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果，证明所设计的LAMP特异性引 物具有种的特异性。同时，反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，成像观察扩增的反应产物，恶 疫霉菌的反应管中的反应液出现了典型阶梯形状条带，而其它疫霉种、真菌、腐霉和阴性对 照菌反应管没有出现梯形条带。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织及土壤中恶 疫霉菌的快速可靠的检测鉴定。当用于发病组织中存在恶疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法 提取恶疫霉菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10 μ L 0. 5M NaOH,在研钵中充分研磨后转移至I. 5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5 μ L上清液加 入495 μ L 0. ImM Tris (pH 8.0)，混匀后取IyL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三 次，同时为确定植株中无 PCR抑制物存在。
[0026] 表1用于检测恶疫霉菌特异性的真菌和卵菌菌株
[0027]
[0028]
【权利要求】
1. 一种用于检测恶疫霉菌的LAMP引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内 引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下： FIP^' - TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3'； BIP:5' -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3'; F3:5' -TTCTGCGCTAGGCGACC-3'; 83:5' -CACACAAGTGGACCGTTAG-3,; LB:5, -GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3，。
2. 权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测恶疫霉菌中的应用。
3. -种检测恶疫霉菌的LAMP试剂盒，其特征在于：包含lmL检测溶液，所述的检测溶 液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物 B3、8mM 环引物 LB、50mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM (NH4)2S04、0.24mM MgS04、 4%Triton X_100、Bst DNA polymerase 320单位，200mM轻基萘酌?蓝；其中，各引物序列具体 如下： FIP:5' -TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3'; BIP:5' -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3，； - TTCTGCGCTAGGCGACC -3'； B3:5， -CACACAAGTGGACCGTTAG-3，； LB# - GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT -3，。
4. 权利要求3所述的检测恶疫霉菌的LAMP试剂盒在检测恶疫霉菌中的应用。
5. -种检测恶疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA 为模板，利用LAMP引物组合物或LAMP试剂盒进行LAMP ;观察LAMP反应溶液颜色变化，天 蓝色表示检测为阳性，存在恶疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在恶疫霉菌。
6. 根据权利要求5所述的检测恶疫霉菌的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA， 取2 ii L DNA溶液，加入23 ii L LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为： 60°C?65°C，50-70min，扩增产物进行颜色变化的观察。
【文档编号】C12Q1/68GK104372099SQ201410699942
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】戴婷婷, 吴小芹, 叶建仁 申请人:南京林业大学