鸭甲肝病毒iii型弱毒株及由其制备的活疫苗和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鸭甲肝病毒III型弱毒株及由其制备的活疫苗和应用，属于鸭甲肝病毒毒株的分离及应用领域。本发明首先分离了一株鸭甲肝病毒III型毒株JS株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.6852；本发明将该毒株经传代致弱选育得到一株性状稳定的鸭甲肝病毒III型弱化毒株JS57株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9708。本发明进一步公开了利用所述鸭甲肝病毒III型弱化毒株制备预防鸭肝炎活疫苗的方法。本发明制备的鸭甲肝病毒活疫苗免疫保护效力高，免疫后的鸭只能获得有效的免疫保护，且安全性好、安全范围宽。
CGMCC No. 9708
20140928
CGMCC No. 6852
20121113
【专利说明】鸭甲肝病毒M I型弱毒株及由其制备的活疫苗和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鸭甲肝病毒毒株，尤其涉及一株分离的鸭甲肝病毒III型强毒株以及 由该强毒株连续传代选育得到的鸭甲肝病毒III型弱化毒株，本发明还涉及该鸭甲肝病毒 III型弱化毒株在制备预防鸭甲肝病毒III型活疫苗中的应用，属于鸭甲肝病毒毒株的分 离及应用领域。
【背景技术】
[0002] 鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus, DHV)是鸭病毒性肝炎的致病病原。国际病 毒分类系统于2010年4月修订：鸭肝炎病毒命名为鸭甲肝病毒DHAV(DHAV)，属小RNA病毒 科，禽肝炎病毒属。目前DHAV分为3个血清型，S卩：血清I型，血清II型和血清III型。其 中血清I型为传统鸭肝炎病毒，血清II型和血清III型为近几年发现的新型病毒株，分别 对应台湾新型和韩国新型。3个血清型之间无交叉反应。
[0003] 随着DHAV I型鸡胚化弱毒疫苗、高免卵黄抗体的研制成功及临床应用，使本病在 很大程度上得到很好的控制。但近几年，在中国山东、河北、广东等地免疫接种过DHAV I型 弱毒疫苗或注射过DHAV I型高免卵黄抗体的鸭群中仍发生鸭肝炎，死亡率为20% -80%。 经病毒分离鉴定为血清III型，即韩国新型。
[0004] 因此，目前亟需要研制一种能够有效预防DHAV III型的活疫苗。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一株鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus, DHAV) III 型强毒株；
[0006] 本发明的目的之二是将所分离的鸭甲肝病毒（duck h印atitis A virus, DHAV) III型强毒株通过传代致弱筛选得到一株弱毒疫苗株；
[0007] 本发明的目的之三是利用筛选的弱毒疫苗株制备得到有效预防鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus, DHAV) III 型的活疫苗。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 本发明首先分离了一株鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus, DHAV) III型毒株， 命名为 DHAV III 型 JS 株（DHAV-JS)。
[0010] 本发明将分离的DHAV III型毒株JS株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物 保藏编号为：CGMCC No. 6852 ;分类命名是：鸭甲肝病毒；保藏时间是：2012年11月13日； 保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳 区大屯路，中国科学院微生物研宄所。
[0011] DHAV-JS株的PCR检测结果显示：在约714bp处出现了特异性的DNA条带。DHAV-JS 株VPl基因序列为SEQ ID NO. 1所示。利用DNAMAN软件，将JS株VPl基因序列与参考毒 株的相应序列进行比较，结果显示：JS株与DHAV血清I型VPl的基因序列核苷酸同源性在 62. 0%?64. 4%之间，JS株与DHAV血清II型VPl的基因序列核苷酸同源性在63. 6%? 63. 8%之间。进化树分析表明，所分离到的JS株与SD02株（DHAV血清III型病毒）的亲 缘关系较近。
[0012] 本发明将分离的DHAV-JS株经过10日龄SPF鸭胚38°C培养5代，10日龄SPF鸭 胚37°C培养12代，9日龄SPF鸡胚37°C适应培养13代，9日龄SPF鸡胚37°C弱化27代，最 终筛选获得一株性能最优良的DHAVIII型鸡胚弱化毒株JS57株。
[0013] 本发明将选育的DHAV III型鸡胚弱化毒株JS57株提交专利认可的机构进行保 藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 9708 ;分类命名是：鸭甲肝病毒III型；保藏时间是： 2014年09月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地 址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0014] 本发明所筛选的鸭甲肝病毒III型鸡胚弱化毒株JS57株能够应用于制备预防由 鸭甲肝病毒III型所导致的鸭病毒性肝炎的疫苗。
[0015] 本发明公开了一种预防鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，包括预防上有效量的鸭甲肝 病毒III型鸡胚弱化毒株JS57株和药学上可接受的冻干保护剂。
[0016] 本发明进一步公开了一种制备鸭甲肝病毒III型活疫苗的方法，包括以下步骤：
[0017] (1)培养DHAV III型鸡胚弱化毒株JS57株，得到病毒液；（2)在病毒液中加入冻 干保护剂，研磨滤过；（3)加入抗生素，充分混合，定量分装；(4)冷冻真空干燥，即得。
[0018] 其中，步骤（1)将DHAV III型鸡胚弱化毒株JS57株接种9日龄SPF鸡胚，挑选在 孵育24?96小时之间死亡的胚胎，收集病毒液。
[0019] 优选的，每0. 2ml病毒液中病毒含量彡106_5ELD5tl方可用于配苗。
[0020] 步骤⑵中所述冻干保护剂的组成如下：甘氨酸、明胶和水；优选的，按g/ml计， 甘氨酸的终浓度为6%，明胶的终浓度为1. 5%，余量为水。
[0021] 其中，步骤（3)所述抗生素包括终浓度分别为1，000IU的青霉素和1，000 μ g/mL 的链霉素；定量分装使每羽份含DHAV多104_°ELD5(i。
[0022] 本发明制备的不同批次活疫苗对雏鸭的免疫结果表明，三批疫苗的免疫试验保护 率为98. 9%。DHAV III型活疫苗（JS57)免疫种鸭，种鸭血清中和抗体效价彡26_°，其下一 代雏鸭可获得有效被动免疫保护。一次单剂量试验说明本发明制备的DHAV III型活疫苗 (JS57)安全性良好；单剂量重复试验说明接种鸭只不会出现接种变态反应。三批疫苗各批 100羽份/只超大剂量注射，接种鸭均健活，剖解无异常症状出现、无肉眼病理变化和肝脏 的病理组织学损伤，说明本发明活疫苗的安全范围比较宽。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024] (1)本发明将分离到的强毒株DHAV-JS株通过连续传代最终筛选获得一株性能稳 定的疫苗弱毒株，获得安全稳定的生产用JS57株毒种；本发明进一步利用该疫苗弱毒株制 备得到有效预防III型DHAV病的活疫苗。
[0025] (2)本发明不同批次活疫苗对雏鸭的免疫试验，注射该活疫苗1羽份/只，对雏鸭 的保护率为98. 9%。
[0026] (3)本发明活疫苗免疫种鸭，种鸭血清中和抗体效价多26_°时，其下一代雏鸭可获 得有效被动免疫保护。
[0027] (4)本发明活疫苗安全性试验、单剂量重复试验说明接种鸭只不会出现接种变态 反应；按照100羽份/只注射雏鸭，在观察时间内，均无任何不良反应，表明本发明制备的 DHAV活疫苗安全性良好，安全范围比较宽。
[0028] 本发明所涉及到的术语定义
[0029] 术语"免疫有效量"是将引发针对鸭甲肝病毒的免疫应答的无毒力活鸭甲肝病毒 株的量。"免疫有效量"将依赖于受体动物的物种、品种、年龄、大小、健康状况等因素。
[0030] 术语"免疫原性"意指无毒力活鸭甲肝病毒能够引发体液和/或细胞免疫应答。
[0031] 术语"分离的"意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料 可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分（例如细胞质或膜 组分）。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。
[0032] 可互换使用的术语"疫苗"或"疫苗组合物"指这样的药物组合物，其包括在动物 中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另 外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括 例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在 经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的 生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已 知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超 过一种上述组分。
[0033] 术语"强毒的"指鸭甲肝病毒毒株引起与鸭甲肝病毒感染相关的疾病的能力。毒 力可以通过观察动物中的疾病进展进行评估。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为DHAV JS株PCR检测结果；其中，1为DHAV JS株PCR扩增结果；2为2000 DNA Marker ;3为阴性对照；
[0035] 图2为DHAV JS株基因测序结果，获得VPl片段714bp ;
[0036] 图3为DHAV JS株和其它几株DHAV VPl的进化树分析。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0038] 实施例1鸭甲肝病毒毒株DHAV-JS株的分离鉴定
[0039] 1、病料分离处理
[0040] 2010年1月，江苏省徐州市某养鸭场3?13日龄雏鸭发生一种急性疾病，死亡率 50%以上，病鸭表现为突然发病、抽搐并很快死亡。剖检可见肝肿胀，其表面有出血点、出血 斑，胆囊充盈，肾轻度淤血，临床症状疑似鸭病毒性肝炎。
[0041] 无菌采集雏鸭的肝、脾组织病料，将其剪碎，磨细，用无菌pH7. 4 PBS作1 :5稀释， 经3, OOOrpm离心30min，取上清液加入抗生素（2, 000IU青霉素和2, 000 μ g/mL链霉素）， 于37°C作用30min，将离心的上清液按4 :1加入三氯甲烷，充分混匀后，置37°C作用60min， 经3, OOOrpm离心30min，取上清液加入抗生素，2, OOOIU青霉素和2, OOO μ g/mL链霉素，于 37°C作用30min作为分尚病毒材料。
[0042] 2、病毒培养
[0043] 将上述病毒分离材料接种10日龄SPF鸭胚，0. 2mL/胚，置38°C孵化箱内孵化，每 天照胚2?4次，观察5d，弃去24h以内死亡鸭胚，将120h以内死亡的胚胎放置4°C?8°C过 夜冷却收缩血管，吸取尿囊液及胚体保存和作无菌检验，并观察胚胎病变。反复冻融3次， 4000rpm离心30min，吸取上清，冻结保存。
[0044] 3、聚合酶链反应
[0045] 参考有关资料（范书才，李虹，袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定[J].中国 预防兽医学报，2009(10) : 770?775.)设计引物：
[0046] Pl：5'-GGTGATTCCAACAGCTTGGTGATG-3' ；
[0047] P2 :5'-TTCCAAATGGAGCTCAAAGGCAAG-3'，
[0048] 扩增VPl基因，大小为714bp。引物由上海生物工程有限公司合成。
[0049] 提取分离的病毒核酸，用RT-PCR法进行扩增然后用TE液悬浮，-20°C保存备用。 以提取的病毒核酸为模板进行PCR扩增，反应体系为：ddH 20 35 yl、10XPCR Buffer 5μ1、 mix dNTP(2. 5mmol/L)4 μ 1、上游引物（50pmol/μ L) 1 μ 1、下游引物（50pmol/μ L) 1 μ 1、模 板DNA 3 μ 1、rTaq酶0. 5 μ 1。优选的最佳反应条件为：95°C预变性5min、94°C变性lmin、 55°C退火lmin、72°C延伸lmin，最后72°C延伸lOmin，共30个循环。产物经1.0%琼脂糖凝 胶电泳检测。结果见图1，在约714bp处出现了特异性的DNA条带。
[0050] 4、分离毒株VPl基因序列分析
[0051] 将PCR扩增的鸭甲肝病毒VPl基因在16°C下连接到PMD18-T载体上，连接体系为： PMD18-T载体0.5 μ 1、Solution I 15 μ 1、目的片段4.5 μ 1。连接时间为15小时，再将获 得的产物10 μ 1全部加入100 μ 1的感受态细胞DH5 α中，于37°C摇床培养1小时，涂布于 AMP+的LB固体培养基上，37°C培养16?18小时，挑取白色菌落于AMP+的LB液体培养基 中，37 °C扩增培养12小时，用试剂盒提取质粒，命名为PMD18-T-VP1，鉴定阳性后，将含有阳 性重组子的菌液寄送上海生物工程有限公司进行测序，并将结果用DNASTAR软件进行序列 分析，结果见图2和图3。
[0052] 测序结果，分离的鸭甲肝病毒VPl基因序列为SEQ ID NO. 1所示。利用DNA MAN软 件，将分离的鸭甲肝病毒株VPl基因序列与参考毒株的相应序列进行比较表明，结果显示： 分离的鸭甲肝病毒株与DHAV血清I型VPl的基因序列核苷酸同源性在62. 0%?64. 4%之 间，与DHAV血清II型VP1的基因序列核苷酸同源性在63.6%?63.8%之间。进化树分析 表明，所分呙到的鸭甲肝病毒株与SD02株（DHAV血清III型病毒）的亲缘关系较近。
[0053] 本发明将分离的鸭甲肝病毒株命名为DHAV III型JS株（DHAV-JS)，本发明将DHAV III型JS株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏 编号为：CGMCC No. 6852。
[0054] 实施例2 DHAV III型鸡胚弱化毒株的选育
[0055] 1、将实施例1得到的病毒分离材料DHAV III型JS株接种10日龄SPF鸭胚，0. 2mL/ 胚，置38°C孵化箱内孵化，每天照胚2?4次，观察5d，弃去24h以内死亡鸭胚，将120h以 内死亡的胚胎放置4°C?8°C过夜冷却收缩血管，吸取尿囊液及胚体保存和作无菌检验，并 观察胚胎病变。反复冻融3次，4, OOOrpm离心30min，吸取上清，冻结保存；按上述方法连续 培养5代，获得毒株JS5 ;
[0056] 2、将毒株JS5接种10日龄SPF鸭胚，0. 2mL/胚，置37°C孵化箱内孵化，每天照胚 2?4次，观察4d，弃去24h以内死亡鸭胚，将96h死亡的胚胎放置4°C?8°C过夜冷却收缩 血管，吸取尿囊液及胚体保存和作无菌检验，并观察胚胎病变。反复冻融3次，4, OOOrpm离 心30min，吸取上清，冻结保存；按上述方法连续培养12代，获得毒株JS17 ;
[0057] 3、将毒株JS17接种9日龄SPF鸡胚，0. 2mL/胚，置37°C孵化箱内孵化，每天照胚 2?4次，观察5d，弃去24h以内死亡鸡胚，将120h以内死胚及活胚全部放置4°C?8°C过 夜冷却收缩血管，吸取少量尿囊液及鸡胚肝脏保存，并作无菌检验，观察胚胎病变。反复冻 融3次，4, OOOrpm离心30min，吸取上清，冻结保存；按上述方法连续培养13代，获得毒株 JS30 ；
[0058] 4、将毒株JS30接种9日龄SPF鸡胚，0. 2mL/胚，置37°C孵化箱内孵化，每天照 胚2?4次，观察4d，弃去24h以内死亡鸡胚，将96h以内死亡的胚胎放置4°C?8°C过夜 冷却收缩血管，吸取尿囊液及胚体保存和作无菌检验，并观察胚胎病变。反复冻融3次， 4, OOOrpm离心30min，吸取上清，冻结保存；按上述方法连续培养27代，最终分离获得一株 性状非常稳定的鸡胚弱化毒株JS57。
[0059] 将 DHAV III 型 JS 株经 SPF 鸡胚传代的 F32、F37、F42、F47、F52、F57、F62、F67 代 鸡胚毒混合毒（胚体+胚液+尿囊膜）接种1日龄易感雏鸭，每一代腿部肌肉注射10只， 0. 2ml/只，观察记录临床症状和死亡情况至5日龄，对存活鸭称量体重后剖杀，取选肝脏观 察病理变化（设10只注射灭菌生理盐水的正常对照）。
[0060] DHAV III型JS株不同代次鸡胚毒接种1日龄雏鸭对体重影响及致病性实验结果 见表1。结果表明：DHAV III型JS株不同代次鸡胚毒随着传代次的增加则对1日龄雏鸭 体重增重的影响和毒力也随着降低，至F42代时对雏鸭体重增重的影响已经不显著，至F47 代时对雏鸭肝脏只有轻微损伤，至F52时对雏鸭体重增重已经无影响，F57?F67代对1日 龄雏鸭肝脏、体重增重均无影响。因此，DHAV III型JS株经SPF鸡胚传57代获得的JS57 株，对雏鸭安全，可以作为生产用毒种。
[0061] 表1接种1日龄维鸭对体重影响及致病性实验结果
[0062]
【权利要求】
1?一株分离的鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus) III型毒株JS株，其特征在于， 其微生物保藏编号为：CGMCC No. 6852。
2. 一株由权利要求1所述鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus) III型毒株JS株连 续传代选育得到的弱化毒株JS57株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 9708。
3. 权利要求2所述的鸭甲肝病毒III型弱化毒株JS57株在制备预防鸭病毒性肝炎活 疫苗中的应用。
4. 一种预防鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，其特征在于：包括免疫有效量的权利要求2 所述的鸭甲肝病毒III型弱化毒株JS57株和生物学上可接受的冻干保护剂。
5. -种制备预防鸭甲肝病毒III型活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)培养权利要求2所述的鸭甲肝病毒III型弱化毒株JS57株，得到病毒液；（2)在病 毒液中加入冻干保护剂，研磨滤过；（3)加入抗生素，充分混合，定量分装；(4)冷冻真空干 燥，即得。
6. 按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述的培养方法包括：将权利要 求2所述的鸭甲肝病毒III型弱化毒株JS57株接种9日龄SPF鸡胚，挑选在孵育24?96 小时之间死亡的胚胎，收集病毒液。
7. 按照权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述冻干保护剂的组成为：甘 氨酸、明胶和水；优选的，按g/ml计，甘氨酸的终浓度为6 %，明胶的终浓度为1. 5 %，余量为 水。
8. 按照权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（3)中优选的，所述抗生素包括终浓 度分别为1，000IU的青霉素和1，000 y g/mL的链霉素，所述定量分装使每羽份含鸭甲肝病 毒彡 104°ELD5。。
9. 由权利要求5至8任何一项所述方法制备得到的鸭甲肝病毒III型活疫苗。
【文档编号】C12N7/00GK104498441SQ201410707329
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】藏玉婷, 丁国杰, 王彬, 宋扬, 孙德君, 李来旭, 李鑫, 张春媛, 于洪涛, 孙凯, 刘远仓, 张祎, 张凤强 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司