西葫芦白粉病显性抗病基因pm1的连锁分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了与西葫芦白粉病显性抗病基因 Pm1 的连锁SSR分子标记（Pm-136），属于蔬菜分子抗病育种【技术领域】，涉及白粉病显性抗病基因的连锁SSR分子标记及其应用。所述的分子标记Pm-136与抗病基因的遗传距离为1.7 cm。利用分子标记Pm-136可快速准确的检测抗病性状转育后代植株是否携带 Pm1 抗病基因，从而显著提高抗病育种效率，缩短育种周期。本发明获得的Pm-136标记具有稳定可靠、操作简单、重复性好等优点，在鉴别抗、感品种和抗病转育单株时具有非常高的利用价值。
【专利说明】西葫芦白粉病显性抗病基因 pm1的连锁分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蔬菜分子抗病育种【技术领域】，具体为一种与西葫芦 L )白粉病显性抗病基因也2连锁的SSR分子标记，以及该标记在检测抗病植株中的应用。
【背景技术】
[0002] 西葫芦是全球范围内普遍栽植的南瓜属重要蔬菜之一，在我国的栽培面积逐年增 力口，特别是近年来保护地设施栽培发展迅速，已成为继黄瓜之后的第二大栽培作物。西葫芦 生产对农民增收、农业结构调整以及丰富人民的菜篮子有着重要意义。
[0003] 白粉病是危害西葫芦中后期生产的重要病害之一，植株感染白粉病后光合作用严 重降低，植株生长缓慢，降低产量与品质，产量损失可达40%左右。西葫芦白粉病主要由单 囊壳菌（和二抱白粉菌侵染导致,西 葫芦对白粉病没有免疫类型，高抗材料也非常少，随着保护地西葫芦生产面积的迅速增加， 在高温高湿的环境下，白粉病的发生变的越来越为严重，已经成为西葫芦生产和制种的主 要障碍。尽管白粉病可采用化学防治，但由于危害西葫芦白粉病的生理小种较多，分化快， 化学药剂很难有效保证生产，而且化学防治污染环境，危害消费者健康。因此，培育和推广 抗白粉病品种是解决这一问题最经济、安全、有效的措施。但目前，传统抗病育种存在抗病 基因转育困难，抗病性状鉴别准确性差，抗病育种效率低、周期长等问题，导致生产中抗病 品种少，不能满足生产需要。紧密连锁的分子标记可以加速抗病育种进程、提高选择的准确 性，是分子标记辅助选择育种的必要条件。而与瓜类白粉病抗性连锁的分子标记的研究主 要集中在西瓜、甜瓜及黄瓜上，国内外至今未见西葫芦的相关研究报道。因此，开发与西葫 芦白粉病抗病基因紧密连锁的分子标记，对于提高西葫芦抗病育种效率，拓展抗病基因应 用范围，保障西葫芦的健康生产具有重要的实际应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有西葫芦白粉病抗病育种技术的上述不足，提供西葫芦白 粉病显性抗病基因的分子标记。本发明的另一目的是提供该西葫芦白粉病抗病基因 /^7的分子标记应用。
[0005] 本发明的一个目的提供西葫芦白粉病显性抗病基因也2的分子标记可通过如下 技术方案实现： 西葫芦白粉病显性抗病基因的连锁SSR分子标记，所述的分子标记为Pm-136,其 具有分子序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
[0006] 为实现上述发明目的获得分子标记是通过以下方案实现的： 所述分子标记的获得方法包括如下步骤： 应用SSR-BSA技术：以西葫芦自交系BS15和BS9分别作为感病和抗病亲本配制&代 分离群体，用SSR引物筛选与西葫芦白粉病显性抗病基因也7连锁的分子标记，得到共显性 分子标记Pm-136,该标记与抗病基因/^7的遗传连锁距尚为I. 7 cM。
[0007] 本发明的另一目的是通过以下方案实现的。
[0008] -种所述分子标记在对西葫芦种质资源白粉病抗病基因的鉴定和转移中的应用。
[0009] 本发明的另一目的是通过以下方案实现的。
[0010] 一种检测西葫芦白粉病抗病基因的方法，用以下的一对分子标记引物PCR扩 增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物： 分子标记Pm-136 : 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 如果用引物Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在白粉 病显性抗病基因/^i。
[0011] 检测方法的条件是：所述PCR反应体积为15yL，其中IOXbuffer 1.5yL，2. 5 mM dNTPs 0· 3μ L，Tag 酶 0· 2μ L，10 μΜ 引物各 0· 3μ L，模版DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15μ L ; PCR反应的条件为DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循 环35次，最后72°C延伸lOmin。
[0012] 本发明的另一目的是通过以下方案实现的。
[0013] 一种筛选抗白粉病抗病基因也2西葫芦的方法，用所述的分子标记对扩增待检西 葫芦基因组DNA，用所述的分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志该待检 西葫芦为存在抗病基因的抗白粉病毒病西葫芦。
[0014] 筛选方法的条件是：所述PCR反应体积为15 μ L，其中IOXbuffer 1. 5 μ L，2. 5 mM dNTPs 0· 3μ L，Tag 酶 0· 2μ L，10 μΜ 引物各 0· 3μ L，模版DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15μ L ; 所述PCR反应的条件为DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 30s，循环35次，最后72°C延伸lOmin。
[0015] 有益效果： 本发明在西葫芦自交系BS9中发现了一个白粉病显性抗病基因也7,其优异的抗病 表现在西葫芦抗病育种中具有重要的利用价值。获得了与抗病基因紧密连锁的分子标记 Pm-136。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转育的方法 导入西葫芦优良自交系BS15中，使其获得白粉病抗性。
[0016] 1、在西葫芦自交系BS9中鉴定了一个白粉病显性抗病基因也7。
[0017] 2、获得与西葫芦白粉病抗病基因也7紧密连锁的共显性分子标记Pm-136。Pm-136 与抗病基因的遗传距离为I. 7 cm。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入 其它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状。
[0018] 3、鉴定方便。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记Pm-136 检测西葫芦抗病基因&i，可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对白粉病 的抗性，加快该抗病基因的利用。
[0019] 4、本发明提出了利用西葫芦白粉病抗病种质资源BS9中抗病基因的方法：利用分 子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良的感病自交系中，利用该方 法成功将抗病基因导入西葫芦优良自交系BS15,使其获得了白粉病抗性。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为分子标记Pm-136与西葫芦抗病基因/^7的遗传连锁图，左边为标记间的图 距； 图2为分子标记扩增带型； Pm-136扩增带型，其中Pl为感病亲本BS15, P2为抗病亲本BS9, Fl为杂交一代；1-23 为以BS15为轮回亲本的回交单株；M :Trans DNA markerll，箭头所指为131 bp特异扩增 条带。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1 西葫芦白粉病显性抗病基因的连锁SSR分子标记，所述的分子标记为Pm-136,其具 有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
[0022] 所述的西葫芦白粉病显性抗病基因也2的连锁SSR分子标记的获得方法，、包括 如下步骤： 应用SSR-BSA技术：以西葫芦自交系BS15和BS9分别作为感病和抗病亲本配制&代 分离群体，用SSR引物筛选与西葫芦白粉病显性抗病基因也7连锁的分子标记，得到共显性 分子标记Pm-136,该标记与抗病基因/^7的遗传连锁距尚为I. 7 cm。
[0023] 所述的分子标记在对西葫芦种质资源白粉病抗病基因的鉴定和转移中的应用。
[0024] -种检测西葫芦白粉病抗病基因也2的方法，包括以下步骤： 用以下的一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物： 分子标记Pm-136 : 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 用所述分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在 白粉病显性抗病基因/^i。
[0025] 进一步的，所述 PCR 反应体积为 15 μ L，其中 IOXbuffer 1.5 μ L，2.5 mM dNTPs 0· 3 μ L，Tag 酶 0.2 μ L，10 μ M 引物各 0.3 μ L，模版 DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15 μ L。所述 PCR 反应的条件为DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循环 35次，最后72°C延伸lOmin。
[0026] -种筛选抗白粉病抗病基因也2西葫芦的方法，用所述的分子标记对扩增待检西 葫芦基因组DNA，用所述的分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志该待检 西葫芦为存在抗病基因的抗白粉病毒病西葫芦。
[0027] 进一步的，所述 PCR 反应体积为 15 μ L，其中 IOXbuffer 1.5 μ L，2. 5 mM dNTPs 0· 3 μ L，Tag 酶 0.2 μ L，10 μ M 引物各 0.3 μ L，模版 DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15 μ L。所述 PCR 反应的条件为DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循环 35次，最后72°C延伸10min。
[0028] 实施例2 本实施例具体描述了所述的与西葫芦白粉病显性抗病基因的连锁SSR分子标记的 获得方法，包括以下步骤： (一）西葫芦自交系BS15与BS9 F2代的创建与表型鉴定： (1)西葫芦自交系BS15 (母本）与BS9 (父本）进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2 代群体。
[0029] (2)F2代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种白粉病 菌孢子，接种15天后进行抗病性状调查。鉴定结果见表1。
[0030]
【权利要求】
1. 西葫芦白粉病显性抗病基因也2的连锁SSR分子标记，其特征在于，所述的分子标记 为Pm-136,其具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
2. -种如权利要求1所述的西葫芦白粉病显性抗病基因也2的连锁SSR分子标记的 获得方法，其特征在于，包括如下步骤： 应用SSR-BSA技术：以西葫芦自交系BS15和BS9分别作为感病和抗病亲本配制&代 分离群体，用SSR引物筛选与西葫芦白粉病显性抗病基因也7连锁的分子标记，得到共显性 分子标记Pm-136,该标记与抗病基因/^7的遗传连锁距尚为1. 7 cm。
3. -种如权利要求1所述的分子标记在对西葫芦种质资源白粉病抗病基因的鉴定和 转移中的应用。
4. 一种检测西葫芦白粉病抗病基因的方法，其特征在于， 用以下的一对分子标记引物PCR扩增待检测西葫芦基因组DNA，并检测扩增产物： 分子标记Pm_136 : 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 用所述分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增片段，则标志着待检测西葫芦存在 白粉病显性抗病基因/^i。
5. 根据权利要求4所述的检测西葫芦白粉病抗病基因的方法，其特征在于，所述 PCR 反应体积为 15iiL，其中 lOXbuffer 1.5iiL，2.5 mM dNTPs 0.3iiL，Tag 酶 0.2iiL， 1〇1^引物各0.3111，模版0嫩3〇1^，加(1(11120至1 5111。
6. 根据权利要求4所述的检测西葫芦白粉病抗病基因的方法，其特征在于，所述 PCR反应的条件为DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循 环35次，最后72°C延伸lOmin。
7. -种筛选抗白粉病抗病基因西葫芦的方法，其特征在于，用权利要求1所述的分 子标记对扩增待检西葫芦基因组DNA，用所述的分子标记Pm-136能够扩增出131 bp的扩增 片段，则标志该待检西葫芦为存在抗病基因的抗白粉病毒病西葫芦。
8. 根据权利要求7所述的筛选抗白粉病抗病基因西葫芦的方法，其特征在于，所述 PCR 反应体积为 15iiL，其中 lOXbuffer 1.5iiL，2.5 mM dNTPs 0.3iiL，Tag 酶 0.2iiL，10 1^引物各0.31^，模版0嫩30叩，加(1(11120至15111。
9. 根据权利要求7所述的筛选抗白粉病抗病基因西葫芦的方法，其特征在于，所述 PCR反应的条件为DNA 95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循 环35次，最后72°C延伸lOmin。
【文档编号】C12Q1/68GK104498484SQ201410717699
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】李海真, 张国裕, 张帆, 贾长才, 姜立纲 申请人:北京市农林科学院