一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用，旨在建立一种使TALEN技术作为细胞株更加科学有效的融合载体的构建方法；其技术要点：该融合蛋白结构为EGFP-_mODC_NLS；其表达载体包含一个EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一对切割NLS的TALEN质粒对；该融合蛋白用于切割NLS信号的TALEN质粒对以及原核表达EGFP_mODC_NLS_TALEN_R蛋白和EGFP_mODC_NLS_TALEN_R蛋白，也可以用于验证TALEN质粒对的转染效率以及在细胞中的活性；属于生物【技术领域】。
【专利说明】一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种融合蛋白，具体地说，是一种用于验证TALEN质粒对的转染效率以及在细胞中的活性及其验证其它质粒的转染效率的融合蛋白，本发明还公开了该融合蛋白的构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]小鼠鸟氨酸脱羧酶(MODC)的中部和C-末端的氨基酸包含两个PEST序列的降解域，这两个降解域促进该蛋白的降解，使蛋白的半衰期很短，该特点在基因功能研究上有很大的应用。
[0003]类转录激活因子效应物核酸酶(transcript1n act ivator-like effectornuclease, TALEN)技术是一种崭新的分子生物学工具。TALEN技术目前已经广泛应用于基因修饰。
[0004]尤其是动物模型和细胞模型的建立。但是，在制作细胞模型，或者敲除细胞某一个基因的时候。都需要把TALEN质粒对通过Lipo2000或者病毒的形式转到细胞中去，但是由于缺乏一个对照，TALEN的转染效率和切割活性存在一个未知数。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明的目的在于建立一种使TALEN技术作为细胞株更加科学有效的融合蛋白及其载体的构建方法。
[0006]为此，本发明提供的前一个技术方案是这样的:该融合蛋白结构为EGFP__mODC_NLS。
[0007]本发明提供的另一个技术方案是这样的:该融合蛋白的表达载体包含一个EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一对切割NLS的TALEN质粒对。
[0008]进一步的，上述的融合蛋白载体的结构为CMV-EGFP_mODC_NLS。
[0009]本发明的另一个目的是提供该融合蛋白的表达载体的制备方法，该方法依次包括下述步骤:
[0010]A)构建 CMV-EGFP_mODC_NLS 表达载体:
[0011]I)用引物 GFP_F: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 和引物 Gfp_R:GGCTCAGCTATGATTCTCACTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA 去扩展 EGFP，回收 PCR 片段；
[0012]2)用引物 mODC_F: TCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGTGAGAATCATAGCTGAGCCA 和引物mODC_R:TCAATCAATTAGACTTTTCTCTTTTTCTTTGGTACCTTCCTCTTCTTTTTGGGCACATTGATCCTAGCAGAAGCAC扩展mODC片段；
[0013]3)融合步骤I)制备的PCR片段和步骤2)制备的mODC片段后，克隆到慢病毒表达载体上。
[0014]B)用Gold gate的方法构建针对NLS的TALEN质粒对
[0015]I) TALEN_F 识别的序列是:TCTGCTAGGATCAATGTGCC ；
[0016]2)识别的序列是
[0017]0慢病毒载体的制备
[0018]将沾慢病毒表达载体和辅助质粒转染到293细胞，然后制备汕慢病毒；同时制备表达I'釓册」7和I'釓册」?的慢病毒。
[0019]0)稳定表达细胞系的制备
[0020]汕慢病毒感染细胞?:5786胚胎干细胞；
[0021〕 ￡) 05786.26？？稳定表达2即？的细胞株感染I从册」7和I从册」?质粒对。
[0022]本发明提供的融合蛋白用于切割13信号的质粒对以及原核表达郎--—
蛋白和蛋白。
[0023]本发明提供的融合蛋白用于验证1^12^质粒对的转染效率以及在细胞中的活性。
[0024]与现有技术相比，本发明提供的技术方案制备方法简单，使用该方法或者制备的稳定表达的细胞株可以很好的用于对照实验，使得I'从别技术做细胞株更加科学有效，该方法不仅可以用于基因功能研究的对照实验，也可以用于药物靶点筛选。
具体实施例
[0025]下面结合具体实施例，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
[0026]实施例1
[0027]本发明提供的一种融合蛋白结构为￡(
[0028]其制备方法是:
[0029]将带有重组质粒的大肠杆菌8121菌种扩大培养，在12-181经1？16过夜诱导，收集所得到的蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清，进行附柱亲和层析；待目的蛋白与附柱结合之后，先用漂洗液洗涤，在用洗脱缓冲液洗涤，在用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20%甘油的？83溶液，之后进行的检测，所得即为纯化的蛋白。
[0030]本发明提供的一种融合蛋白的表达载体，包含一个融合蛋白及其一对切割13的I'釓別质粒对；其结构为
[0031]上述的融合蛋白的表达载体的制备方法，依次包括下述步骤:
[0032]八)构建表达载体:
[0033]1)用引物即?」7: ^166X6^60^66606^66^ 和引物: 66010^601^16^11010^010001X6X^0^60X06X00^X6006^ 去扩展 2即？，回收？邙片段；
[0034]2)用引物 11100(:3: 10660^X66^06^60X6X^0^666^6X6^6^X0^X^60X6^600^ 和引物111000,^:10^10^11^6^01111010111110111661^00110010110111116660^0^116^1001^60^6^60^0扩展000(:片段；
[0035]3)融合步骤1)制备的？⑶片段和步骤2)制备的000(:片段后，克隆到慢病毒表达载体上。
[0036]8)用职仏的方法构建针对13的I从册质粒对
[0037]1)其中I从册」7识别的序列是； 1^120识别的序列是:
[0038]0汕慢病毒载体的制备
[0039]将沾慢病毒表达载体和辅助质粒转染到293细胞，然后制备汕慢病毒；同时制备表达I'釓册」7和I'釓册」?的慢病毒。
[0040]0)汕稳定表达细胞系的制备
[0041〕 汕慢病毒感染细胞?:5786胚胎干细胞；
[0042]￡) 05786.26？？稳定表达2即？的细胞株感染I从册」7和I从册」?质粒对。
[0043]稳定表达26？？的单克隆挑选出来后，扩大培养制备成稳定表达(^?的05786细胞株，然后感染和质粒对。6个小时后，观察发现定位在细胞质里面，而细胞核没有(^--。
[0044]该融合蛋白用于切割13信号的I从册质粒对以及原核表达
I'八[册」?蛋白和蛋白或者用于验证I'釓別质粒对的转染效率以及在细胞中的活性。
[0045]具体方法为:
[0046]对细胞内源性基因以0？4与(1^5的敲除，用的05786细胞株作为对照。
[0047]首先设计细胞内源性基因(1^5的I从別质粒对，I从册-?:0？5」？。
[0048]制备I从册立，1^12^-001^5^ 慢病毒。
[0049]用打靶13序列的I从册慢病毒感染稳定表达的05786细胞；用I从册立，1^12^-001^5^慢病毒感染另外的05786细胞。感染24小时后，发现稳定表达的05786细胞⑶？从细胞核转移到细胞质。同时收集细胞，提取转染I从册立，1^12^-001^5^慢病毒的细胞基因组，利用引物
？1: 0X600X0060X0X^0X0^0X661 与(^咫―1？1:^11001666^6^6^060^0^0)扩增含有打靶位点的片段，作测序验证，结果显示，使用该方法从册-(05立，1^12^-001^5^对细胞内源基因001？5有切割活性，该方法可以成功用于对照实验。
【权利要求】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白结构为EGFP-_mODC_NLS。
2.一种融合蛋白的表达载体，其特征在于，该表达载体包含一个权利要求1所述的EGFP-_mODC_NLS融合蛋白及其一对切割NLS的TALEN质粒对。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白载体，其特征在于，所述的表达载体结构为CMV-EGFP_mODC_NLS。
4.制备权利要求2所述的融合蛋白的表达载体的方法，其特征在于，依次包括下述步骤: A)构建CMV-EGFP_mODC_NLS 表达载体: 1)用引物GFP_F:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 和引物 Gfp_R:GGCTCAGCTATGATTCTCACTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA 扩展 EGFP，回收 PCR 片段； 2)用引物mODC_F:TCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGTGAGAATCATAGCTGAGCCA 和引物mODC_R:TCAATCAATTAGACTTTTCTCTTTTTCTTTGGTACCTTCCTCTTCTTTTTGGGCACATTGATCCTAGCAGAAGCAC扩展mODC片段； 3)融合步骤I)制备的PCR片段和步骤2)制备的mODC片段后，克隆到慢病毒表达载体上。 B)用Goldgate的方法构建针对NLS的TALEN质粒对: 1)TALEN_F识别的序列是:TCTGCTAGGATCAATGTGCC ； 2)TALEN_R 识别的序列是:TTTTCTCTTTTTCTTTGGTA。 C)pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒载体的制备 将pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒表达载体和辅助质粒转染到293细胞，然后制备pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒；同时制备表达TALEN_F和TALEN_R的慢病毒。 D)pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS稳定表达细胞系的制备 pLV_CMV-EGFP_mODC_NLS慢病毒感染细胞C57B6胚胎干细胞； E)C57B6_EGFP稳定表达EGFP的细胞株感染TALEN_F和TALEN_R质粒对。
5.权利要求1所述的融合蛋白用于切割NLS信号的TALEN质粒对以及原核表达EGFP_mODC_NLS_TALEN_R 蛋白和 EGFP_mODC_NLS_TALEN_R 蛋白。
6.权利要求1所述的融合蛋白用于验证TALEN质粒对的转染效率以及在细胞中的活性。
【文档编号】C12N15/867GK104497146SQ201410719532
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】霍依然, 李红梅, 覃启红, 黄龙 申请人:广州古藤兰生物科技有限公司