基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法
【专利摘要】一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，属于河口生态需水量计算领域，选择当地一种分布范围较广的贝类生物作为实验对象，按照当地实际盐度范围，设定不同盐度区域，以河口正常盐度为对照盐度区域；分别向设定的不同盐度区域投放等量的贝类，测定不同时间点所取样品的抗氧化系统酶活力值，筛选对盐度变化有显著响应的酶活指标；然后，利用新型耦合生物标志物响应法将优选的抗氧化酶活力值标准化后进行耦合，确定出现显著性差异的盐度区域为生物的响应阈值范围；最后，利用生物的响应阈值范围与正常盐度浓度的差值进行生物生态需水量的估算。本发明选择贝类这种游动性不强的物种，降低干扰风险。同时，将研究水平推进到分子水平，提高了河口生态需水量计算的准确性。
【专利说明】基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于河口生态需水量计算领域，具体涉及一种基于贝类耦合生物标志物响 应的河口生态需水量估算方法。
【背景技术】
[0002] 河口是海陆交界、咸淡水交汇的地带，其特有的自然环境特征和生态调节功能在 维持全球生态平衡方面具有十分重要的地位。河口地区的盐度受上游河流径流量等的影响 经常处于波动状态，在正常生态状况下河口生物能够通过自身的调控作用适应这种盐度变 化。然而，近年来，河口地带由于气候因素、环境因素以及各种人为因素等的影响，尤其是在 干旱季节径流量逐年减少甚至出现断流，河口盐度急剧升高，河口生态环境的自我调节功 能越来越弱，生物多样性也逐年降低，这使得河口生态与环境的负面效应日益凸显。目前生 态环境比较脆弱的河口地区很多，包括黄河流域、海河流域等的河口地带，几乎每年都会出 现断流现象，盐度等水质指标发生较大波动，盐度是影响生物生长、发育、繁殖的重要指标， 它的变化对河口地区生物的分布和生存起到至关重要的作用，甚至会破坏该地区的整个生 态系统的平衡。因此，选择合适的河口生物作为研究对象，计算维持其正常生活状态下的生 态需水量显得尤为重要，同时也为河流水资源生态调度的合理配置以及维护河口生态环境 生物资源多样性提供了技术支撑和科学依据。
[0003] 河口生态需水是在一定生态目标下维持河口相应时空范围内生态系统健康所需 要的水量。多年来，国内外学者对河口生态需水进行了大量研究，却因为生态需水计算涉及 的研究点太多而未形成统一的计算方法体系。本发明主要是选取其中总生态需水量中的一 个研究点（河口生物的生态需水量）进行研究，目前对河口生物的生态需水量主要是通过 分析生物种群数量以及分布等对盐度、温度等的适应能力来计算，这种计算方式精确度往 往不高。当生物受到一定的环境胁迫后，首先在自身抗氧化系统各种抗氧化酶的调控作用 下进行一系列的生理生化反应来适应外界的变化，当自我调控能力不足以应对外界的胁迫 时，便会产生逃逸、死亡等一系列的外在行为，因而及早的发现生物的受胁迫状态，及时的 为其改善生存环境显得尤为重要。目前已经有大量研究利用抗氧化系统酶活变化来检测海 洋或河流污染物对生物的影响。
[0004] 禹合生物标志物响应法"（IBRv2)由 Wilfried Sanchez 等（Wilfried Sanchez, Thierry Burgeot, Jean-Marc Porcher. A novel "Integrated Biomarker Response，'calculation based on reference deviation concept. Environ Sci Pollut Res, 2012)研究而成，在此之前也有人用 Beliaeff 等（Beliaeff B, Burgeot T. Integrated biomarker response:A useful tool for ecological risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry, 2002,21 (6) :1316-1322)所研究的f禹合生物标志物响应法 (IBR)进行生态环境污染评估，然而IBR在使用中存在一定的局限性。IBRv2相对于IBR的 适用范围更广，计算方式更加便捷，而且在其星状图中可以清楚的显示胁迫因子对单一指 标的抑制或者诱导作用，能够更好的展示耦合效果。利用IBRv2获得耦合数据后，对数据进 行显著差异性分析，获得盐度胁迫阈值范围。然后，利用所确定的盐度阈值范围与实际环境 盐度的差值来估算生物的生态需水量，该方法在河口生物生态需水量计算方面尚未见到报 道。
[0005] 目前关于生物生态需水研究，主要是针对鱼类的种群数量和分布变化从群体水平 来计算生物的生态需水量，但此方法精确度不高。另外，鱼类的游动性也增加了研究的干扰 风险，使研究的真实性降低。所以，对河口贝类生物盐度胁迫阈值范围的确定以及贝类生物 生态需水量的估算方法的建立是本发明的关键所在。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态 需水量估算方法。
[0007] 本发明选择贝类这种游动性不强的物种，降低干扰风险。同时，将研究水平推进到 分子水平，提高了河口生态需水量计算的准确性。
[0008] 本发明是由如下技术方案实现的：
[0009] -种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，它的步骤：首先， 选择当地一种分布范围较广的贝类生物作为实验对象，按照当地实际盐度范围，设定不同 盐度区域，以河口正常盐度为对照盐度区域；分别向设定的盐度区域投放等量的贝类，在实 验过程中设置不同的取样时间点，测定不同时间点所取样品的抗氧化系统酶活力值，研究 酶活指标与盐度因子之间的时间-效应关系，利用SPASS中的一维方差分析法进行显著差 异性分析，筛选对盐度变化有显著响应的酶活指标；然后，利用新型耦合生物标志物响应法 将优选的抗氧化酶活力值标准化后耦合，获得新型耦合生物标志物响应，建立新型耦合生 物标志物响应与盐度因子之间的剂量-效应关系模型，再次进行显著差异性分析，确定出 现显著性差异的盐度区域为生物的响应阈值范围；最后，利用生物的响应阈值范围与正常 盐度浓度的差值进行贝类生态需水量的估算。
[0010] 一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，具体步骤包括如 下：
[0011] ⑴实验对象的选择：从正常盐度区域选取当地分布广泛、容易采集、体积适中的 一种贝类生物，采集后用于后续实验；
[0012] ⑵试验区域的选择：按照当地实际盐度范围，设定不同盐度区域，以河口正常盐度 为对照盐度区域；分别向设定的盐度区域投放等量的贝类，整个实验进行14d，分别在第0、 l、2、4、8、15d取样用于后续酶活测定实验；
[0013] ⑶抗氧化系统酶活测定：测定不同时间点取样贝类的超氧化物歧化酶、过氧化 氢酶、谷胱甘肽-S转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶（、过氧化物酶、7-乙氧基-3-同吩嗯唑 酮?脱乙基酶酶活性；
[0014] ⑷筛选抗氧化系统敏感酶指标：用SPASSR中的ANOVA进行显著差异性分析，选取 不同盐度下活力有显著差异性变化的酶进行酶活分析；
[0015] (5)绘制IBRv2与盐度的剂量-效应关系，获得生物的响应阈值范围，
[0016] a首先将数据计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均€Xi ;
[0017] b降低数值差异性：Yi = Iog(XiAtl) ,Xtl为相应取样时间点下每一个生物标志物所 有试验水平的Xi的平均值；
[0018] c数据标准化：X标准化得到Y，Yi = (X-u) /s,其中u和s是计算每一个生物标志 物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；
[0019] d确定一个生物标志物偏差指数A = Zi-Ztl 为相应取样时间点下每一个生物标 志物所有试验水平的Zi的平均值；
[0020] e将所有偏差指数相加即为新型耦合生物标志物响应值，也即IBRv2，
【权利要求】
1. 一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，其特征在于它的步 骤：首先，选择当地一种分布范围较广的贝类生物作为实验对象，按照当地实际盐度范围， 设定不同盐度区域，以河口正常盐度为对照盐度区域；分别向设定的盐度区域投放等量的 贝类，在实验过程中设置不同的取样时间点，测定不同时间点所取样品的抗氧化系统酶活 力值，研究酶活指标与盐度因子之间的时间-效应关系，利用SPASS中的一维方差分析法进 行显著差异性分析，筛选对盐度变化有显著响应的酶活指标；然后，利用新型整合生物标志 物法将优选的抗氧化酶活力值标准化后耦合，获得新型整合生物标志物响应，建立新型整 合生物标志物响应与胁迫因子之间的剂量-效应关系模型，再次进行显著差异性分析，确 定出现显著性差异的盐度区域为生物的响应阈值范围；最后，利用生物的响应阈值范围与 正常盐度浓度的差值进行生物生态需水量的估算。
2. 根据权利要求1所述的基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法， 其特征在于它的具体步骤包括如下： ⑴实验对象的选择：从正常盐度区域选取当地分布广泛、容易采集、体积适中的一种 贝类生物，采集后用于后续实验； ⑵试验区域的选择：按照当地实际盐度范围，设定不同盐度区域，以河口正常盐度为对 照盐度区域；分别向设定的盐度区域投放等量的贝类，整个实验进行14d，分别在第0、1、2、 4、8、15d取样用于后续酶活测定实验； ⑶抗氧化系统酶活测定：测定不同时间点取样贝类的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶 (SOD)、谷胱甘肽-S转移酶（GST)和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px)、过氧化物酶（POD)、 7-乙氧基-3-同吩嗯唑酮?脱乙基酶酶（EROD)活性； ⑷筛选抗氧化系统敏感酶指标：用SPASSR中的ANOVA进行显著差异性分析，选取不同 盐度下活力有显著差异性变化的酶进行酶活分析； (5) 绘制IBRv2与盐度的剂量-效应关系，获得生物的响应阈值范围， a首先将数据计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均€Xi ; b降低数值差异性：Yi = Iog(XiAtl) ,Xtl为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试 验水平的Xi的平均值； c数据标准化：X标准化得到Y，Yi = (X-u) /s,其中u和s是计算每一个生物标志物所 有试验水平的总体平均值和标准偏差； d确定一个生物标志物偏差指数A = Zi-Ztl 为相应取样时间点下每一个生物标志物
所有试验水平的Zi的平均值； e将所有偏差指数相加即为新型整合生物标志物响应，也即IBRv2 绘制IBRv2与盐度的剂量-效应关系，出现显著性差异的盐度区域为生物的响应阈值 范围，由此判断，高于这个盐度范围便会对生物构成破坏效应； (6) 生物生态需水量估算公式：IF= ISa-TvlV= ISa-Tv1 |V?ISa-Tv2IV ;其中Tv1? Tv2为响应阈值范围，Sa为河口实际盐度，V整个目标区域的水量，IF生物生态需水量。
【文档编号】C12Q1/26GK104388535SQ201410727151
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】孙雪梅, 夏斌, 陈碧鹃, 曲克明, 崔正国 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所