一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法
【专利摘要】本发明提供了一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，通过将大鼠乳腺组织小块消化后，将离心沉淀细胞洗涤、重悬、吹散以及过滤处理后，再将细胞经多次瞬时离心，将沉淀细胞制备为悬液，将悬液的乳腺上皮细胞调整密度后接种培养。本发明步骤简单，经过3小时的酶消化便可获得大量活力较高的细胞；此外，本发明极大程度的降低了成纤维污染，经角蛋白和酪蛋白检测结果显示本发明获得的乳腺上皮细胞纯度高且具备良好的分泌功能。
【专利说明】一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养【技术领域】，尤其涉及一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法。
【背景技术】
[0002]现有的大鼠乳腺上皮细胞培养方法为组织贴块培养法和胶原酶消化法，其中组织贴块培养法时间长，步骤繁琐，细胞易污染，且获得的上皮细胞不均一，影响实验的重复性；胶原酶消化法培养尽管能短时间内获取大量的细胞，但大量的成纤维细胞被消化下来，乳腺上皮细胞纯度低，贴壁后，乳腺上皮细胞最终被更易增殖的成纤维细胞所取代。本发明克服了组织贴块培养法步骤繁琐、易污染的缺点，采取胶原酶与透明质酸酶联合消化并结合多次瞬时离心分离乳腺上皮细胞，尽可能的去除了细胞沉淀中的成纤维细胞，同时在培养液中添加胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白等生长因子，促进了乳腺上皮细胞的生长，维持乳腺上皮细胞的体外分泌功能。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，旨在解决原代分离培养的乳腺上皮细胞纯度低，易被成纤维细胞污染的问题。
[0004]本发明是这样实现的，一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，包括以下步骤:
[0005](1)采集大鼠乳腺组织，将大鼠乳腺组织预处理后剪碎为11111113大小的大鼠乳腺组织小块，将所述组织小块悬浮于消化液中，在371消化31！；
[0006](2)消化结束后，离心取细胞沉淀，用含10%胎牛血清的培养液洗涤3次以去除脂肪，将细胞重悬于培养液中，吹散细胞，经100目网筛过滤以去除未消化的组织和碎片；
[0007](3)细胞经多次瞬时离心，弃去上清，向沉淀的上皮细胞中加入0121作12培养液制备成细胞悬液；
[0008](4)将悬浮的乳腺上皮细胞密度调至5 X從此―1，以每孔2此接种于六孔板或每孔100 ^ I接种于96孔板中，置371、5% 002条件下培养，48卜后第1次换液，去除未贴壁的红细胞和碎片，以后每3(1换液1次。
[0009]优选地，在步骤(1)中，所述大鼠乳腺组织为妊娠15?18天的大鼠第四、五对乳腺组织；
[0010]所述预处理为将采集的乳腺组织剥离脂肪组织和结缔组织，置于灭菌培养皿中，预冷的0-^11^’ 8液漂洗三次。
[0011〕 优选地，在步骤⑴中，所述消化液的组成为:101中包括211^ I型胶原酶、100口透明质酸酶以及100口青链霉素。
[0012]优选地，在步骤(2)中，所述含10%胎牛血清的培养液的组成为:0121/512培养液与胎牛血清的体积比为9:1。
[0013]优选地，在步骤(3)中，所述瞬时离心为1000转/分离心1分钟，重复10次。
[0014]优选地，在步骤⑶中，所述0腿1/512培养液的组成为:111110腿1/512中包括100口青链霉素、5 0 8胰岛素、1 ^ 8氢化可的松、5 0 8转铁蛋白、10118表皮生长因子、2 0 11101 1-谷氨酰胺及0.11111胎牛血清。
[0015]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明步骤简单，经过3小时的酶消化便可获得大量活力较高的细胞；此外，本发明极大程度的降低了成纤维污染，经角蛋白和酪蛋白检测结果显示本发明获得的乳腺上皮细胞纯度高且具备良好的分泌功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是大鼠乳腺上皮细胞形态观察图；
[0017]图2是大鼠乳腺上皮细胞角蛋白荧光免疫检测图；
[0018]图3是乳腺上皮细胞@ -酪蛋白的免疫印迹法检测结果图。
【具体实施方式】
[0019]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020]实施例
[0021](1)选择妊娠15?18天的大鼠，无菌采集第四、五对乳腺组织，尽量剥离脂肪组织和结缔组织，置于灭菌培养皿中，预冷的0-他成’ 8液漂洗三次。用眼科剪剪成约1皿3大小的乳腺组织小块，悬浮于消化液(0腿1/512中添加2呢/此I型胶原酶，100^1透明质酸酶、100^/此青链霉素)371消化3匕。
[0022](2)消化结束后，离心取细胞沉淀，用含10%胎牛血清的培养液洗涤3次以去除脂肪，将细胞重悬于培养液中，大口吸管吹散细胞，经100目网筛过滤以去除未消化的组织和碎片。
[0023](3)细胞经多次瞬时离心(1000转/分离心1分钟；重复10次)，弃去上清(多为红细胞、成纤维细胞、内皮细胞等)，向沉淀的上皮细胞中加入0121/512培养液制备成细胞悬液，培养液中含10011/111[青链霉素、5 4 8/此胰岛素、8/此氢化可的松、5 0 8/此转铁蛋白、10118/1^表皮生长因子、2臟01凡卜谷氨酰胺及10%胎牛血清。
[0024](4)将悬浮的乳腺上皮细胞密度调至5 X從此―1，以每孔2此接种于六孔板或每孔100 ^ I接种于96孔板中，置371、5% 002条件下培养，48卜后第1次换液，去除未贴壁的红细胞和碎片，以后每3(1换液1次。
[0025]用荧光免疫法和1606111 610七分别检测角蛋白和￠-酪蛋白，如图1?3所示，图1为大鼠乳腺上皮细胞形态观察图(200^),其中，八图为细胞24?48卜内贴壁，呈现岛屿状连接；8图为培养后5山细胞铺满培养板，融合成单层细胞。图2为大鼠乳腺上皮细胞角蛋白荧光免疫检测图(200^),其中，八图为乳腺上皮细胞呈角蛋白阳性，图为阴性对照；8、0图均为0八？1复染细胞核。图3为乳腺上皮细胞13 -酪蛋白的免疫印迹法检测结果图，其中，泳道1为尬，泳道2、3、4为分离培养的乳腺上皮细胞提取物，结果显示酪蛋白分泌为阳性。由上图结果显示分离培养的为上皮细胞，且具有乳腺分泌功能。
[0026]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采集大鼠乳腺组织，将大鼠乳腺组织预处理后剪碎为Imm3大小的大鼠乳腺组织小块，将所述组织小块悬浮于消化液中，在37°C消化3h ； (2)消化结束后，离心取细胞沉淀，用含10%胎牛血清的培养液洗涤3次以去除脂肪，将细胞重悬于培养液中，吹散细胞，经100目网筛过滤以去除未消化的组织和碎片； (3)细胞经多次瞬时离心，弃去上清，向沉淀的上皮细胞中加入DMEM/F12培养液制备成细胞悬液； (4)将悬浮的乳腺上皮细胞密度调至5X15Hir1,以每孔2mL接种于六孔板或每孔100 μ L接种于96孔板中，置37°C、5% CO2条件下培养，48h后第I次换液，去除未贴壁的红细胞和碎片，以后每3d换液I次。
2.如权利要求2所述的大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，其特征在于，在步骤(I)中，所述大鼠乳腺组织为妊娠15?18天的大鼠第四、五对乳腺组织； 所述预处理为将采集的乳腺组织剥离脂肪组织和结缔组织，置于灭菌培养皿中，预冷的D-Hank ’ s液漂洗三次。
3.如权利要求2所述的大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，其特征在于，在步骤(I)中，所述消化液的组成为:1ml DMEM/F12中包括2mg I型胶原酶、100U透明质酸酶以及100U青链霉素。
4.如权利要求3所述的大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述含10%胎牛血清的培养液的组成为:DMEM/F12培养液与胎牛血清的体积比为9:1。
5.如权利要求4所述的大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述瞬时离心为1000转/分离心I分钟，重复10次。
6.如权利要求5所述的大鼠乳腺上皮细胞原代培养的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述DMEM/F12培养液的组成为:lmlDMEM/F12中包括100U青链霉素、5 μ g胰岛素、I μ g氢化可的松、5 μ g转铁蛋白、1ng表皮生长因子、2 μ mo I L-谷氨酰胺及0.1ml胎牛血清。
【文档编号】C12N5/071GK104403992SQ201410738484
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】顾蓓蓓, 卢劲晔, 刘俊栋, 卢炜, 刘静, 陆江, 马卉, 苗晋锋 申请人:中华人民共和国泰州出入境检验检疫局, 江苏农牧科技职业学院