花生AhRRS22基因及其在烟草抗青枯病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种花生青枯病抗性相关基因 AhRRS22 及其超表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程【技术领域】。本发明的花生抗性基因 AhRRS22 基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。通过构建CaMV 35S启动子驱动 AhRRS22 基因植物表达载体，转化农杆菌，通过叶盘法将其导入翠碧一号烟草上，对转基因烟草进行青枯菌的接种，进而对其进行抗性鉴定，结果证明提高了该转基因对烟草的抗青枯病性。表明该基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。
【专利说明】花生AhRRS22基因及其在烟草抗青枯病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种花生青枯病抗性相关基因及其超表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]花生ΛArachis hypogaea L.)是国际上重要的油、食兼用经济作物。花生青枯病是影响花生生产的重要病害，主要在长江流域和南方地区造成严重危害，是花生品种必须检验的病害。近年来发现花生青枯病有向北蔓延趋势，河南、山东均报道有青枯病发生(庞振凤，2009)。花生青枯病通常情况下引起减产10%-30%，严重时可造成50%以上甚至绝收。目前对植物青枯病尚无行之有效的化学药剂防治办法，被称为植物的“癌症”，现主要采用栽培手段进行控制，难以从根本上解决病害的发生；防治青枯病的根本手段还是培育抗病品种。实践证明此抗病基因源对我国各地区不同类型的青枯菌均具有广谱抗性。因此，花生抗表枯病基因研究对解决花生等植物青枯病问题具有重大意义。
[0003]随着大规模测序和功能基因组学研究的深和发展，越来越多的植物与病原菌互作的分子机理被阐释，但是作物青枯病的抗性分子机理研究还处于初级阶段。目前除拟南芥外在重要农作物上还没有获得抗青枯病基因，对青枯菌侵染后植物的抗病反应机制还不清晰，其涉及的信号转导途径研究的还不透彻。通过大规模EST测序以及基因芯片技术能够从一定水平上解析植物在病原菌胁迫下整个基因组水平的基因表达情况，从分子水平上剖析植物的抗病机理和信号转导途径，发掘抗性相关基因以及开发抗性相关的分子标记等坐寸ο
[0004]随着分子生物学和功能基因组学的发展，基因芯片技术已经成为高通量有效筛选差异基因表达的重要手段。基因表达谱芯片能够提供很多重要信息比如不同组织器官和不同类型的细胞的转录组差别，不同的生长发育阶段和病原菌侵染前后的基因表达差异，不同物种间或者同一物种不同个体之间的基因表达情况等。Luo等报道了花生受黄曲霉和干旱胁迫诱导的第一张cDNA芯片，这张芯片包括两个生物和非生物胁迫的cDNA文库中的384个unigenes，其中52个基因受黄曲霉和干旱诱导上调，42个基因只受干旱胁迫诱导上调。Guo等在2011年报道了一个60-70mer的长片段的核苷酸表达谱芯片，从中筛选受黄曲霉胁迫的相关基因。
[0005]本发明针对以上【背景技术】，在本实验室454测序获得的大规模EST序列的基础上，合成了自主研发含有101，344条unigenes的基因芯片,通过抗青枯病花生品种在接种青枯菌和非接种的mRNA与其杂交获得了大量的基因表达差异的信息，对青枯菌诱导差异表达上调39倍的蓮因进行全长cDNA的克隆，该基因的编码产物定位在细胞膜上，其在烟草中超表达可显著提高转基因烟草对青枯病的抗性，表明在植物应答青枯病菌信号传递中起着重要的调节作用，这就为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。
【发明内容】
[0006]本发现提供了一种受青枯菌诱导上调表达的花生蓮因及其在烟草抗青枯病基因工程中的应用，将大力促进烟草抗青枯病基因工程的发展与应用。
[0007]本发明提供了一种花生蓮因，该基因含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]花生蓮因能够显著提高烟草青枯病的抗性能力，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。
[0009]本发明的花生AWP7P5.公基因主要通过抗青枯病花生品种在接种青枯菌和非接种的mRNA与其杂交获得了大量的基因表达差异的信息，对青枯菌诱导差异表达上调39倍的基因进行全长cDNA的克隆，克隆全长基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]本发明还提供了包含所述花生蓮因的超表达载体；以及，所述超表达载体的构建方法:酶切连接替换植物表达载体PBI121-GUSA中的⑶S基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS22基因的植物表达载体pBI121-AhRRS22-0E。
[0011]最后，本发明提供了所述的花生蓮因或所述的超表达载体在烟草等植物抗青枯病基因工程中的应用。
[0012]本发明的花生AhRRS2龜因功能鉴定是通过酶切连接替换植物表达载体pBI 121-GUSA中的GUS基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS2龜因植物表达载体pBI121-AhRRS22-0E,将其转化EHA105农杆菌，通过叶盘法将其导入翠碧一号烟草上，对转基因烟草进行青枯菌的接种，进而对其进行抗性鉴定，结果证明提高了该转基因对烟草的抗青枯病性。
[0013]本发明的花生蓮因超表达烟草相比野生型烟草对青枯病抗病能力显著提高，表明该基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为RACE获得蓮因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA的电泳图；
图2为过量表达载体的构建及验证；
图3为细胞定位结果；
图4为在转基因烟草中超表达对青枯病侵染的抗性。
【具体实施方式】
[0015]【实施例1】RACE获得蓮因3’未知序列和5’未知序列
根据花生非生物和生物胁迫454测序的转录组合成花生的表达谱基因芯片(罗氏公司合成)，利用抗青枯病品种接种前后芯片杂交筛选青枯菌诱导前后基因的差异表达获得候选基因片段，设计一对基因引物 PRRS _22_F (5，-TGAGGTTGTCTGATCAGAGCACAG-3’)和PRRS_22-R (5’-GATCGAATAGTCTCCCTGTAAGGT-3，);再根据模板单链 cDNA 合成过程所加的接头序列 RACE-F (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT)和 RACE-R (ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd (T) 30N-1N-3’)，利用 PRRS_22_R 引物和 RACE-F 引物以及 PRRS _22_F 引物和 RACE-R引物配对分别进行V 和:V - RACE反应，5' -RACE反应条件是94°C 5min — (94°C30s ^ 60 °C 30s ^ 72 °C 2min) 30 cycles ^ 72 °C 1min ；3 ; -RACE 反应条件是 94 °C5min— (94°C 30s ^ 72 °C 2min)5cycles — (94 °C 30s ^ 60 °C 30s ^ 72 °C 2min) 30cycles — 72°C 1min ;根据生物信息学预测的目的条带基因的大小对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序。将获得的5'和3'未知序列经拼接后获得其全长cDNA序列，根据全长cDNA序列设计全长cNDA引物AhRRS22_ FL_F(5’_TGACGCGATATCTGTAAAGTGTGA-3’)和 AhRRS22_FL_R (5， -AAGATACACTCAATTGAGATCTGC-3’)引物从单链cDNA扩增获得全长cDNA序列，对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序并保存质粒。蓮因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA克隆的电泳图如图1所示；其全长cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。其全长cDNA序列长度为1795bp，编码461个氨基酸，5’ -UTR长度为40bp，3’ -UTR长度为372bp，含有32bp poly (A)尾巴。
[0016]【实施例2】超表达载体构建与验证
通过 AhRRS22-0E-F (5 ’-ATTAGGATCCATGGCGGAAGCTTGGTTGTG-3’)和 AhRRS22_0E_R(5，-ATTTAGGCGCGCCTATCTAGCATCGATTAATTCCTTGAC-3，)这对弓 I物从具有完整读码框的质粒中扩增得到包括终止密码的蓮因cDNA开放阅读框，5'端3'端分别带有BamHl和Ascl酶切位点，对本实验室构建的由2XCaMV 35S启动子驱动的pBI121_GUSA和扩增得到的AhRRS22g的片段同时用BamHl (购自NEB公司)和Ascl (购自NEB公司)双酶切，回收目的片段，用T4连接酶16°C过夜连接，转化到大肠杆菌DH5a菌株，构建p35S::AhRRS22_0E超表达载体，经过PCR验证以及酶切验证确定其载体构建的正确性，其载体图如图2所示。通过液氮冻融法转化农杆菌EHA105以备烟草转基因用。
[0017]【实施例3】蓮因表达产物的亚细胞定位
对于亚细胞定位载体,通过 AhRRS22-SL-F( 5，-ATTAGGATCCATGGCGGAAGCTTGGTTGTG-3，)和 AhRRS22-SL-R (5，-ATTTAGGCGCGCCATCTAGCATCGATTAATTCCTTGAC-3’)这对引物从具有完整读码框的质粒中扩增得到不包括终止密码的蓮因cDNA，5'端3'端分别带有BamHl和Ascl酶切位点，对本实验室构建的pBI_GFP和扩增得到的蓮因同时用BamHl和Ascl双酶切，经过连接和转化构建p35S: 'AhRRS22..:GFP载体。通过液氮冻融法转化农杆菌GV3101，以p35S::GFP作对照，农杆菌渗入法转化本氏烟草，25°C培养48h后用荧光显微镜观察绿色荧光(激发光波长为488nm，发射光波长为532nm)。结果显示AhRRS2遙因的编码产物定位在细胞膜上(图3所示)。
[0018]【实施例4】烟草的遗传转化和转基因烟草的PCR鉴定
采取根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，把分别带有质粒P35S::AhRRS22-0E超表达载体的农杆菌通过叶盘法转化烟草品种翠碧一号(CB-1),用100mg/L卡那霉素(Kan)筛选叶芽及根系生长，在培养过程中用500 mg/L头孢霉素(Cef )来抑制农杆菌的生长，培养条件温度25 °C ±2°C，光照每天14h白天/1h黑夜。共培养培养基:MS培养基+0.1mg/L NAA (a-萘乙酸)+ lmg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤)，，诱导筛选培养基:MS培养基+0.1mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+ 100 mg/L kam +500mg/L Cef,生根培养基:MS 培养基 +50mg/L Kan+500mg/L Cef。NAA, 6-BA, kan 和 Cef 购自 Sigma 公司。
[0019]根据35S启动子和AhRRS2龜因序列设计一对引物引物35S-F (5 ’ -TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’ )和 AWPTdR (5，-CTGTGCTCTGATCAGACAACCTCA-3’)，CTAB 法提取转基因与非转基因烟草DNA，以两种转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，利用设计的35S-F和AhRRS22~R进行PCR扩增。PCR反应体系为:10 X buffer 2.Ομ?，dNTP1.5Pl，35S_F 0.5μ1, AhRRS22~R 0.5μ1，Taq 酶 0.?μ?，ddH20 14.4μ1，模板 DNA 1.Ομ?，总体积为 20μ1。反应程序为:94 V 5 min—(94 V 30 s — 57V 30 s — 72 V 60 s)40cycles — 72 °C 1min — hold at 4。。。
[0020]【实施例5】AWPTC表达转基因烟草的青枯病抗性鉴定
将获得的转基因烟草TO代抗病株系进行套袋自交收获Tl代转基因种子，利用T2代转基因种子进行转基因烟草表型分析与功能鉴定。将T2代转基因株系的种子以及野生型成熟种子分别种子无菌水浸泡24h，75%酒精30s，10%过氧化氢lOmin，无菌水清洗5_6次，播种MS培养上,十五天后,移栽于育苗盘,一个月后选取大小一致的苗移栽于小花盆中培养9周后，对烟草种子进行青枯菌叶脉注射接种处理，处理15后，超表达烟草植株相对于野生型对照表现出对病原菌侵染的明显抗性，野生型烟草出现整株萎蔫甚至死亡。相同试验至少重复三次以上，均有同一趋势结果。结果发现，转基因烟草对青枯病菌明显强于野生型对照(图4)，说明与了植物对青枯病菌的抗性作用。
【权利要求】
1.一种花生抗性基因，命名为蓮因，该基因含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的花生抗性基因，其特征在于:所述的蓮因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.包含如权利要求1所述花生抗性基因的超表达载体。
4.一种如权利要求3所述超表达载体的构建方法，其特征在于:酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的⑶S基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS22基因的植物表达载体pBI121-AhRRS22-0E。
5.一种如权利要求1所述的抗性基因或权利要求3所述的超表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK104498504SQ201410741527
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】张冲, 庄伟建, 陈华, 邓烨, 蔡铁城 申请人:福建农林大学