一种四环素发酵补料培养基及补料方法
【专利摘要】本发明涉及一种四环素发酵补料培养基及补料方法，本发明根据菌体不同生长代谢阶段对速效氮源和磷量需求的不同，通过改善菌体不同生长阶段补入糖水中速效氮源及磷的量，从而达到提高四环素发酵的发酵水平的目的。实验证明，发酵到60-100小时开始补入低磷的糖水，可有效控制初级代谢速度，减少溶氧需求，同时利于次级代谢产物的生成，四环素产量明显提高。本发明提高的方法简单易行，对类似方式控制的发酵均有借鉴意义。
【专利说明】-种四环素发酵补料培养基及补料方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制药【技术领域】，特别是设及一种四环素发酵补料培养基及补料方 法。
【背景技术】
[0002] 四环素是W金色链霉菌为发酵菌株，发酵生产出来的抗菌物质。四环素对革兰氏 阳性菌、阴性菌、立克次氏体、滤过性病毒、螺旋体W及原虫类都有很好的抑制作用，是一种 光谱抗生素。
[0003] 现有技术中，W金色链霉菌做出发菌株发酵过程中，全程补入含大量碳氮源、磯元 素的混合糖水，会存在中后期因磯量过高，初级代谢速度过快，次级代谢产物合成受阻的问 题，同时因初级代谢快，菌丝量过大，造成溶氧的缺乏，造成发酵液发酸转红情况。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于客服上述现有技术的缺陷，提供一种可满足生长期菌体生长繁 殖速效氮源及磯量的需求，同时平衡合成期初次级代谢关系，充分改善溶氧状况，提高发酵 单位的四环素发酵补料培养基。
[0005] 本发明的另一目的是提供利用上述补料培养基的补料方法。
[0006] 为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
[0007] 一种四环素发酵补料培养基，其特征在于是由混合糖水A和混合糖水B组成，其中 [000引所述混合糖水A的组成为；淀粉250-500g/l，玉米浆25-30g/l，漠化钢 1. 25-3. 75g/l，轻质碳酸巧 3. 75g-12. 5g/l，M-促进剂 0. 0125-0. 025g/l，硫酸锭 Og-2. 5g/ 1，淀粉酶；0. 25g/l ;
[0009] 所述混合糖水B的组成为；淀粉250-500g/l，玉米浆10-15g^，漠化钢 1. 25-3. 75g/l，碳酸巧 3. 75-12. 5g/l，M-促进剂 0. 0125-0. 025g/l，硫酸锭 0-2. 5g/l，淀粉 酶；〇. 25g/l。
[0010] 利用上述四环素发酵补料培养基的补料方法，其特征是；在W金色链霉菌为生产 菌种发酵生产四环素的发酵过程中，
[0011] 1)在发酵15-2化r，当总糖低于5. 0 %时补入混合糖水A ;
[0012] 2)在发酵60虹后，总糖低于5. 0 %时补入混合糖水B ;
[001引从开始补糖至发酵70小时控制总糖在4. 8 % -4. 0 %，70小时后控制总糖 4. 0% -2. 0%至放罐。
[0014] 在发酵过程的前20小时，发酵液抑控制在6. 1-5. 8,在发酵过程的20小时后，发 酵液抑控制在5. 8-5. 6,过程中用氨水调节抑。
[0015] 研究表明，四环素发酵过程中，前期要有较快的初级代谢速度W产生足够量的菌 丝，中后期随着补料增加，体积增大，需氧量较大，同时进入产物合成期要控制初级代谢速 度W利于次级代谢进行，所W控制好该两阶段磯量，就可W即改善溶氧状况，同时加速产物 合成。
[0016] 本发明正是在上述研究结果的基础上，根据菌体不同生长代谢阶段对速效氮源和 磯量需求的不同，通过改善菌体不同生长阶段补入糖水中速效氮源及磯的量，从而达到提 高四环素发酵的发酵水平的目的。实验证明，发酵到60-100小时开始补入低磯的糖水，可 有效控制初级代谢速度，减少溶氧需求，同时利于次级代谢产物的生成，四环素产量明显提 高。实验证明；四环素发酵到60小时后补入速效氮源中磯含量是60小时前补入糖水磯量 1/2的糖水，发酵单位可W提高10%。本发明提高的方法简单易行，对类似方式控制的发酵 均有借鉴意义。
【具体实施方式】
[0017] 为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明作进行一步说明，但所举实施 例并不限制本发明的保护范围。
[001引下述实施例中，固体培养基、种子培养基和发酵培养基按照现有技术W金色链霉 菌为生产菌种发酵生产四环素的方法所选，可W选择如下：
[0019] 固体培养基组成；款皮2.5-4. 0%，琼脂1.5-2. 0%，磯酸氨二胺0.01-0. 02%，磯 酸氨二钟 0. 005-0. 010%，硫酸儀 0-0. 01 %。
[0020] 种子培养基组成；淀粉15-30g^，豆粉15-20g^，玉米浆0. l-l.Og^，硫酸锭 1. 5-6. Og/1，轻质碳酸巧 1. 0-2. 5g/l，漠化钢 1. 0-2. Og/1。
[0021] 发酵培养基组成；淀粉80-100g/l，豆粉30-50g^，玉米浆20-40g^，硫酸锭 2. 5-6. 5g/l，轻质碳酸巧4-6g/l，漠化钢1. 0-2. Og/1，磯酸二氨钟0. 05-0. lg/1，淀粉酶 0. 2-0. 4g/l〇
[0022] 实施例1
[0023] 1、斜面抱子制备：将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35°C恒温培 养4-5天，后接种于种子培养基中。
[0024] 2、种子培养；将步骤1生长好的斜面抱子无菌方式接种于种子培养基中，接种 量为500ml茄形瓶装量的15 %，32 °C恒温培养，通气比为0.6-0. 8v/v/min，揽拌转速为 400-600r/min，培养 20-26 小时。
[0025] 3、发酵培养；将步骤2培养好的种子无菌条件接种于发酵培养基中，接种量为 10-20%，控制培养温度0-40虹:33°C ,41-80虹；32°C，80虹-放罐31°C，过程通气比； 0. 8-1. 5v/min,保证过程溶氧不低于20%，培养6-8天。
[0026] 4、糖水配制；
[0027] 4. 1混合糖水A组成；淀粉250g/l，玉米浆30g/l，漠化钢1. 25g/l，碳酸巧3. 75g/ 1，M-促进剂0. 0125g/l，硫酸锭Og/1，淀粉酶0. 25g/l。
[002引 4. 2混合糖水B组成；淀粉250g^，玉米浆15g/l，漠化钢1. 25g/l，碳酸巧3. 75g/ 1，M-促进剂0. 0125g/l，硫酸锭Og/1，淀粉酶0. 25g/l。
[0029] 4. 3 W上物料分别W培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。
[0030] 5、过程补糖水控制；
[0031] 发酵液总糖低于5.0%，生长20小时左右时，补入混合糖水A ;发酵液总糖低于 5. 0%，生长60小时后换补比W上糖水中速效磯减半的混合糖水B，控制至放罐；从开始补 糖至70小时控制总糖在4. 8% -4. 0%，70小时后4. 0% -2. 0%至放罐。整个发酵过程中用 氨水调节抑，在发酵前20小时，发酵液抑控制在6. 1-5. 8, 2在发酵20小时后，发酵液抑 控制在5. 8-5. 6,过程中用氨水调节pH。发酵过程中利用流加消沫剂或油方式进行消沫。
[0032] 6、对照实例；
[0033] 6. 1 W上 1. 2. 3 条相同。
[0034] 6. 2混合糖水采用组成为：淀粉250g^，玉米浆30g/l，漠化钢1. 25g/l，碳酸巧 3. 75g/l，M-促进剂0. 0125g/l，硫酸锭Og/1，淀粉酶0. 25g/l。按重量体积比配制成20L， 后湿热蒸汽灭菌。
[0035] 6. 3发酵过程总糖低于5.0 %开始补入，开始补糖至70小时总糖控制在 4. 8% -4. 0%，70小时后在4. 0% -2. 0%，过程用氨水调节抑。
[0036] 7、试验结果数据：
[0037]
[003引 实验例2
[0039] 1、斜面抱子制备：将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35°C恒温培 养4-5天，接种于种子培养基中。
[0040] 2、种子培养；将步骤1生长好的斜面抱子无菌方式接种于种子培养基中，接种 量为500ml茄形瓶装量的15 %，32 °C恒温培养，通气比为0.6-0. 8v/v/min，揽拌转速为 400-600r/min，培养 20-26 小时。
[0041] 3、发酵培养；将步骤2培养好的种子无菌条件接种于发酵培养基中，接种量为 10-20%，控制培养温度0-40虹:32 °C ,41-80虹；31°C，80虹-放罐30 °C，过程通气比； 0. 8-1. 5v/min,保证过程溶氧不低于20%，培养6-8天。
[0042] 4、糖水配制；
[0043] 4. 1混合糖水A组成；淀粉375g^，玉米浆25g/l，漠化钢2. 5g^，碳酸巧7. 5g^， M-促进剂0. 019g/l，硫酸锭1. 25g/l，淀粉酶0. 25g/l。
[0044] 4. 2混合糖水B组成；淀粉375g^，玉米浆lOg/1，漠化钢2. 5g^，碳酸巧7. 5g^， M-促进剂0. 019g/l，硫酸锭1. 25g/l，淀粉酶0. 25g/l。
[0045] 4. 3 W上物料分别W培养基重量体积比配制后，湿热灭菌。
[0046] 5、过程补糖水控制；
[0047] 发酵液总糖低于5. 0%，生长15小时时，补入混合糖水A ;发酵液总糖低于5. 0%， 生长60小时后换补比W上糖水中速效磯减半的混合糖水B ;开始补糖至70小时控制总糖 在4. 8% -4.0%，70小时后4.0% -2.0%至放罐。整个发酵过程中用氨水调节抑，在发酵 前20小时，发酵液抑控制在6. 1-5. 8, 2在发酵20小时后，发酵液抑控制在5. 8-5. 6,过程 中用氨水调节pH。发酵过程中利用流加消沫剂或油方式进行消沫。
[0048] 6、对照实例；
【权利要求】
1. 一种四环素发酵补料培养基，其特征在于是由混合糖水A和混合糖水B组成，其中 所述混合糖水A的组成为：淀粉250-500g/l，玉米浆25-30g/l，溴化钠1. 25-3. 75g/ 1，轻质碳酸钙 3. 75g-12. 5g/l，M-促进剂 0? 0125-0. 025g/l，硫酸铵Og-2. 5g/l，淀粉酶： 〇.25g/l； 所述混合糖水B的组成为：淀粉250-500g/l，玉米浆10-15g/l，溴化钠1. 25-3. 75g/l， 碳酸钙 3. 75-12. 5g/l，M-促进剂 0? 0125-0. 025g/l，硫酸铵 0-2. 5g/l，淀粉酶：0? 25g/l。
2. -种利用权利要求1所述的四环素发酵补料培养基的补料方法，其特征是：在以金 色链霉菌为生产菌种发酵生产四环素的发酵过程中， 1) 在发酵15_25hr，当总糖低于5. 0%时补入混合糖水A; 2) 在发酵60hr后，总糖低于5. 0%时补入混合糖水B; 从开始补糖至发酵70小时控制总糖在4. 8%-4. 0%，70小时后控制总糖4. 0%-2. 0%至放 罐。
3. 按照权利要求2所述的补料方法，其特征是：在发酵过程的前20小时，发酵液pH控 制在6. 1-5. 8,在发酵过程的20小时后，发酵液pH控制在5. 8-5. 6,过程中用氨水调节pH。
【文档编号】C12R1/49GK104513845SQ201410748075
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】章慧霞, 李学兵, 孙瑞君, 罗少奋, 张志
申请人:宁夏启元药业有限公司