一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法
【专利摘要】本发明公开了一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法，该方法利用固相萃取法提取有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，染毒90天后固定、包埋、脱蜡、洗涤、消化、闭液、洗涤、显色观察肝脏细胞发生的变化，本研究中，随染毒剂量升高，大鼠肝细胞凋亡指数逐渐升高，尤以中、高剂量组明显。进一步进行相关性分析发现肝细胞的凋亡存在剂量依赖性。提示该地饮用水有机污染物较高剂量亚慢性暴露可诱导大鼠肝细胞发生细胞凋亡。本方法不但能从形态上观察凋亡细胞和凋亡小体，同时也能了解其分布并进行定量分析，是标记凋亡细胞较可靠的方法。
【专利说明】-种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法
【技术领域】
[0001] 一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法，属于卫生检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 关于有机污染物致肝脏损伤的机制尚无统一定论，涉及的学说众多：如苯并芘和 滴滴涕可引起肝细胞凋亡、多氯联苯可致肝微粒体CYPlAl酶活力异常改变、二氯溴烷能够 诱导肝细胞腺瘤形成等。其中，细胞凋亡作为一种由基因控制的程序性细胞死亡，在保持 器官和组织的稳定性方面起着重要作用，不正常的凋亡调控可以引起组织器官损伤乃至 癌症等疾患。近年来多项研究表明肝细胞凋亡在肝病的发生、发展中发挥着重要作用，参与 许多肝脏疾病的病理过程。凋亡过度或不足都会导致不同程度的肝损伤，如爆发性肝衰竭、 肝硬化、病毒性肝炎、自身免疫性肝病以及肝脏肿瘤等。近年的研究也多认为各种原因引起 的肝细胞损伤与细胞凋亡有着密切的关系。检测细胞凋亡的方法很多，有形态学观察法、标 记法、流式细胞仪技术、ELISA法，本实验使用的方法不但能从形态上观察凋亡细胞和凋亡 小体，同时也能了解其分布并进行定量分析，是标记凋亡细胞较可靠的方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是：提供一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法，能直观的发 现肝脏的损害情况。
[0004] 本发明的技术方案 一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法，该方法利用固相萃取法提取有机污染 物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，染毒90天后固定、包埋、脱蜡、洗涤、消化、闭液、洗 涤、显色观察肝脏细胞发生的变化，以达到直观、清楚地观察肝细胞凋亡的部位及数量。
[0005] 前述的一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法中，采用固相萃取法富集水中 有机污染物，萃取剂为XAD-2树脂，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，水样过柱流速为4倍柱体积 /min，过柱完后依次用3倍柱体积的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流速0. 1倍柱体积/min，洗 脱液经旋转蒸发仪25°C减压蒸馏挥干，将已挥干的浓缩提取物用玉米油定容至50L/ml (母 液）-200C冰箱保存备用。 前述的一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法中，将40只SD大鼠按随机区组法 分为4组，每组10只，雌雄各半，1组为对照组（予玉米油），其余3组为低、中、高剂量染毒 组，依据预实验结果，确定大鼠染毒高剂量组剂量为80L饮用水有机污染物提取物/kg. bw. day,向下设置低、中2个剂量组，分别为20L/kg. bw. day，5L/kg. bw. day。
[0006] 由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，由于随染毒剂量升高，大鼠肝细胞凋 亡指数逐渐升高，尤以中、高剂量组明显。进一步进行相关性分析发现肝细胞的凋亡存在剂 量依赖性。提示该地饮用水有机污染物较高剂量亚慢性暴露可诱导大鼠肝细胞发生细胞凋 亡。本实验使用的方法不但能从形态上观察凋亡细胞和凋亡小体，同时也能了解其分布并 进行定量分析，被认为是标记凋亡细胞较可靠的方法。
【具体实施方式】
[0007] 下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[0008] 1材料与试剂 1材料 1. 1主要试剂及其配制 1. 1. 1主要的试剂 脱脂奶粉（武汉博士德公司）；甲醇（上海生工）；过硫酸铵（APS)、Tween 20、Tris、甘 氨酸、SDS、二甲苯：上海碧云天公司。
[0009] I. L 2 试剂的配制 10XTBS Tris、24. 2gNacl、80g加700ml蒸馏水溶解后用IMoIHcI调PH至7. 6,再加蒸馏水定 容至IL 2. 2主要的仪器 高速台式冷冻离心机（Sigma 2-16k，美国Sigma公司）、显微镜（BX51，日本奥林巴斯公 司）、透射电子显微镜（日立H-7650,日本日立公司）、抽真空型脱水机（Leica TP1020,德 国徕卡公司）、生物组织石蜡包埋机（YB-6LF，孝感市亚光医用电子科技公司）、旋转式超薄 切片机（LEICA RM2135,德国徕卡公司）、徕卡摊片机（HI1210,德国徕卡公司）、徕卡烘片机 (HI1220,德国徕卡公司）。
[0010] 2实验方法 (1)载玻片预先用多聚赖氨酸浸泡处理，大鼠肝脏组织用10%多聚甲醛固定，石蜡包 埋制作切片。
[0011] (2)肝脏切片常规脱蜡入水：将切片依次浸入二甲苯I lOmin、二甲苯II lOmin、 95% 乙醇 I 4min、95% 乙醇 II 3min、80% 乙醇 2min、蒸馈水洗 lmin。
[0012] (3)新鲜配制3%乙酸（ρΗ=2· 5)室温处理IOmin,蒸馈水洗漆2minX3次。
[0013] (4)标本切片上滴加 0· OlM TBS ((pH=7) 1:200 新鲜稀释 Proteinase K 37oC 消化 IOmin,用 0· OlM TBS 洗 2minX3 次。
[0014] (5)按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各?μ?，加入到18μ1标记缓冲液中，充分混匀 配成标记液。甩去切片上多余液体后加标记液，按2〇μ1/片，置于湿盒中，37 〇C标记2h。
[0015] (6) 0· OlM TBS 洗 2minX3 次。
[0016] (7)在切片上滴加封闭液3〇μ1/片，室温反应30min,甩掉封闭液，不洗。
[0017] (8)用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀后5〇μ1/片加至标本 片上并置于湿盒中，37oC反应50min。0. OlM TBS洗2minX3次。
[0018] (9)用抗体稀释液1:100稀释SABC-AP，混匀后5〇μ1/片加至切片上。37〇C反应 60min。0.01M TBS 洗 5minX4 次。
[0019] (10) DAB避光显色：取Iml蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混 匀后加至标本片上，37°C显色20?30min左右(显微镜下控制时间）。充分水洗。
[0020] (11)苏木素轻度复染Imin, 0. OlM TBS洗,蒸馈水洗lmin、80%乙醇2min、95%乙 醇I 3min、95%乙醇II4min、二甲苯I IOmiru二甲苯II lOmin，中性树胶封片。
[0021] (12)结果判断：光镜观察，细胞核呈棕黄色或其中有棕黄色颗粒者为阳性细胞， 即凋亡细胞。凋亡率（Al)的计算：每张切片随机取10个高倍镜视野（X400)，计数视野 中凋亡细胞数占视野细胞总数的百分比，肝脏细胞总数应不少于1000个。
[0022] 2 结果 随着染毒剂量的升高，肝脏细胞的凋亡率呈上升趋势，与对照组比较，中高剂量组升高 明显，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)，详见表9。
[0023] 细胞凋亡率与染毒剂量呈正相关关系，相关系数r=0. 5683 (P〈0. 05)，回归方程为 Y=0. 118X+6. 197 (Y为细胞凋亡率，X染毒剂量）；与血清CHE水平呈正相关关系，r=0. 4054 (P〈0. 05)，回归方程为Y=0. 570X+115. 006 (Y为血清CHE水平，X为肝脏细胞凋亡率）。
【权利要求】
1. 一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法，其特征在于：该方法利用固相萃取法 提取有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，染毒90天后固定、包埋、脱蜡、洗涤、消 化、闭液、洗涤、显色观察肝脏细胞发生的变化，以达到直观、清楚地观察肝细胞凋亡的部位 及数量。
2. 根据权利要求1所述的一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法，其特征在于：采用固相萃取法富集水中有机污染物，萃取剂为XAD-2树脂，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，水 样过柱流速为4倍柱体积/min，过柱完后依次用3倍柱体积的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流 速〇. 1倍柱体积/min，洗脱液经旋转蒸发仪25°C减压蒸馏挥干，将已挥干的浓缩提取物用 玉米油定容至50L/ml (母液）-200C冰箱保存备用。
3. 根据权利要求1所述的一种有机污染物致大鼠肝脏细胞凋亡的方法，其特征在于：将40只SD大鼠按随机区组法分为4组，每组10只，雌雄各半，1组为对照组（予玉米油）， 其余3组为低、中、高剂量染毒组，依据预实验结果，确定大鼠染毒高剂量组剂量为80L饮用 水有机污染物提取物/kg. bw. day，向下设置低、中2个剂量组，分别为20L/kg. bw. day，5L/ kg. bw. day。
【文档编号】C12Q1/06GK104498581SQ201410750636
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】敖云霞 申请人:敖云霞