一种蜘蛛线粒体nd4基因全序列扩增引物及鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种蜘蛛的线粒体 ND4 基因全序列扩增引物，并利用其全序列测序信息快速鉴定蜘蛛种类的方法，包括蜘蛛基因组总DNA的提取， ND4 基因全序列扩增引物的设计，PCR扩增和测序，以及基于 ND4 碱基序列进行蜘蛛种类的快速鉴定。本发明可以快速、高效和特异地扩增多种蜘蛛的线粒体 ND4 基因的全序列，不仅能为蜘蛛种类的快速鉴定，种群多样性分析提供一个有力的工具，也能应用于蜘蛛不同分类阶元系统进化的分析研究。
【专利说明】一种蜘蛛线粒体基因全序列扩增引物及鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种蜘蛛线粒体NADH还原酶复合体亚基4(NADH dehydrogenase subunits 4; ND4)基因的全序列扩增引物及鉴定的方法。
【背景技术】
[0002]蜘蛛是重要的害虫捕食性天敌，在有害生物综合防治过程中具有重要的作用和地位。注意保护天敌种库，促进天敌群落重建，能有效的控制诸多农业害虫，诸如飞虱、叶蝉、螟虫、棉蚜等的发生和危害。快速而准确的物种鉴定是蜘蛛保护和利用的研究的必要前提和基础。然而，基于外观形态及解剖特征的传统分类鉴定方法不仅耗时耗力，而且对鉴定人员的专业知识和经验要求较高，常受主观因素的干扰，极易混淆出错。另一方面，蜘蛛种类繁多，对其开展区系分类研究也极为重要，这对蜘蛛种质资源有效保护利用具有重要意义。
[0003]蜘蛛线粒体基因组由13个蛋白质基因，22个tRNA基因，2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)共37个编码基因及一段非编码区(控制区)组成，具有母系遗传，拷贝数多，重组率低，进化速度较快等优点。其中线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (COI)基因已作为公认的分子标记，应用于蜘蛛等节肢动物的群体遗传学，系统发生学及保护生物学等研究领域。
作为线粒体蛋白质编码基因中7个编码NADH还原酶复合体亚基的基因之一，进化速率适中，亦可以应用于蜘蛛种类的快速鉴定，系统进化及分类研究。然而扩增线粒体癌因序列的通用引物鲜有报道，尤其是针对种类繁多，具有重要利用价值的蜘蛛类。因此，设计特异性扩增蜘蛛线粒体癌因全序列的通用引物，从而为高效获得蜘蛛线粒体癌因全序列及其线粒体全基因组序列奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种蜘蛛线粒体ND4基因全序列扩增引物及鉴定方法。
[0005]发明的技术方案如下:
本发明首先提供了一对蜘蛛线粒体癌因全序列的通用扩增引物，这对引物是根据GenBank数据库中已经公布的蜘蛛线粒体全基因组序列设计的，正向引物ND4-F如SEQ IDNO:1所示，反向引物ND4-R如SEQ ID NO:2所示:
SEQ ID NO:1: 5' -CCTAATCCATCTCAACCTA-3';
SEQ ID NO:2: 5' - TTCTAGTCTTAATAGTAT-3'。
[0006]利用上述一对蜘蛛线粒体ND4基因全序列扩增引物，PCR扩增测序后可实现对蜘蛛种类的快速鉴定。具体包括以下步骤:
(I)采用DNA抽提试剂盒提取蜘蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。
[0007](2)利用上述的一对引物，以抽提好的蜘蛛基因组为模板，进行PCR扩增和测序(结果见图1)。PCR反应体系为50μ 1，其中:2μ I模板DNA (约20ng)，5 μ I 10XPCRbuffer, 4 μ I 2.5mM MgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.5 μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50 μ I ;PCR反应条件为:95° C预变性3分钟，94° C变性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸I分钟；35个循环后，72° C再延伸7分钟。
[0008](3) PCR产物测序，对测序结果进行处理分析，使用ClustalX软件进行DNA序列比对。达到物种鉴定的目的。
[0009]作为优选，本发明所述的鉴定方法中，其中步骤(I)所述的蜘蛛种类包括但不限于下述:拟水狼蛛{Pira ta subpira ticus)，三突花蛛{Ebrech tella tricuspida ta),横纹金蛛(Arg1pe bruennichi)，维腹肖蛾(Jetragnatha maxi I 1sa)，华 _ 肖蛾{Tetragnatha,茶色新圆蛛(Afe1scofla iAeisi)、脉蜗蛛(fet/ic1sa venatrix) >黑色妮虎 iPlexippus ,大腹园蛛(Araneus Feflirico1SW1S)、猫跳蛛 iCarrhotusxantho gramma)。
[0010]本发明的优点是:
1.本发明提供的蜘蛛线粒体ND4基因的序列扩增引物，可以高效的扩增多种蜘蛛的线粒体ND4基因的全序列，而不仅仅是部分序列，能应用于蜘蛛不同分类阶元系统进化和分类研究；
2.本发明所述的通用引物及其设计方法可以作为通用引物PCR扩增原理及关键参数研究的具体实例，促进本发明所涉及领域的发展，因而具备重要的发明价值和理论意义；
3.该方法所述的物种鉴定方法可以对多种蜘蛛进行准确鉴定，且不受发育阶段和个体残缺的限制，大大克服了形态鉴定的困难，缩短了鉴定的周期；该种蜘蛛的分子生物学鉴别方法对使用的仪器设备要求较低，且无需复杂的技术步骤和昂贵的试剂，一般的技术人员均可操作，比传统的形态学鉴别更准确可靠。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明中蜘蛛线粒体ND4基因全序列扩增引物用以扩增不同种类蜘蛛线粒体ND4基因全序列的电泳图谱。
[0012]其中，M: DNA分子量标准(Mark IV) ; 1_10泳道依次为拟水狼蛛，三花突蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛾，华丽肖蛾，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛、猫跳蛛。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明实施例1:
(I)蜘蛛样品的采集，鉴定及保存
实施例中所用蜘蛛种类均用陷阱法采自浙江省余姚市农田。所采标本带回实验室进行信息登记，均用体视显微镜鉴定，以确定种类，用于分子生物学实验的蜘蛛标本用100%的酒精浸泡并保存于4° C冰箱备用。所采集的蜘蛛种类包括:拟水狼蛛，三花突蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛾，华丽肖蛾，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛、猫跳蛛。
[0014]蜘蛛基因组总DNA的提取
采用DNA抽提试剂盒提取不同种类蜘蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。DNA直接利用DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取。提取的总基因组-20° C保存备用。
[0015]设计合成蜘蛛线粒体癌因全序列的扩增引物
登陆NCBI网站中的GenBank数据库收索已公布的蜘蛛全线粒体基因组序列，经ClustalW软件同源比对,找出卿癌因上下游保守的序列,利用Premier primer 5.0软件设计出蜘蛛线粒体Μ)癌因全序列扩增引物并送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。正向引物ND4-F如SEQ ID Ν0:1所示，反向引物ND4-R如SEQ ID Ν0:2所示:
SEQ ID NO:1: 5' -CCTAATCCATCTCAACCTA-3';
SEQ ID NO:2: 5' - TTCTAGTCTTAATAGTAT-3'。
[0016]PCR扩增线粒体ND4基因全序列和序列测定
利用上述的一对引物，以抽提好的蜘蛛基因组为模板，进行PCR扩增。其中，PCR反应体系为 50 μ 1，其中:2 μ I 模板 DNA (约 20ng)，5yl 10XPCR buffer, 4 μ I 2.5mMMgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.5 μ I 5U/μ I TaqDNA 聚合酶，加去离子水调至终体积50 μ I ;
PCR反应条件为:95° C预变性3分钟，94° C变性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸I分钟；35个循环后，72° C再延伸7分钟。
[0017]PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测(结果见图1)，扩增片段用凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)割胶回收。回收产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
[0018]依据全序列信息快速确定蜘蛛的种类。
[0019]对上一步测序结果进行处理分析，用ClustalX软件进行序列信息比对，进行物种鉴定。
[0020]通过引物测得蜘蛛的癌因全序列如下:
拟水狼蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:3所示:
ATAAAAATTATTTTACCAATAATCTCTTTAATCTTCTTTATAAATAACATTTCAATAATTATAATCTATTT
ATCAATTATAACAATTACAATATTATTTACTTATAATACAAAACATATAATAATTATAGATAATTCATTCATATTA
GATAAATTCTCTATAATCTTAATTTTATTAACCCTAATAAGAATCTTATTAATTATATTTTCTTCTCAAAATATAAA
TATAATCTCTAATATAATTATTCCAATTTTCATAATTTTAATATTAACTTTTTCAGTTATAAATATATTATCATTTT
ATATTCTATTTGAATTAGTATTAATTCCTACAATAATTTTAGTAATAAAATCAGGAAAACAACCTGAACGCTTACAA
GCCAGAATTTACTTAATATTATATACCATTACAGCTTCACTCCCTCTCTTAGTTAGTATTATTTTATTAAATTATAA
TCAATCATTCATTATATCATTCATAATAATAAATAAATTAAATATACCTTTACTATTTATATTAGCATTTTTAGCAA
AAATACCAATATTTTTCACTCATTTATGATTACCAAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCGTAGAAGGGTCAATAATTCTC
GCAGCAGTTTTATTAAAACTCGGCGGATATGGACTGATTCGATTTAGACCTCTTCTTTATGCCAAAACTATCCCATT
AAACTTCTGAATTTCTAGAATCAGTTTAATTGGAGCAATTATAACAAGAATAAATTGTATCCGACAAAAAGATTTAA
AATCTCTAATTGCTTACTCTTCAGTTGCCCATATAGGTCTAGTTCTAGCTAGAATTATAACCCTAAATTTCATCGGA
TTTTACGGAGCAATCTTAATAATAGTAGCCCATGGTCTATCCTCATCAGCCTTATTCCTAATAGTTAATATAATTTA
TACTAAACATCATACACGAAACATTATTTCATTTAAGGGTTTATGAAATTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGAT
TTGTCTTCATTGCAGCTAATATTTCCGCACCTCCTTCAATTAACTTAGCCGGAGAAATTTTTATTTTAATAAGTCTT
ATTAATTTAAATATTCTAATTCTAATCCCTTTTATTTTCATTTCATTAATAACTTCTATCTTTTCAATTACATTATTTTTAAACACAGTACATAACCAACCTAATTCTATTTTAGCTTCCTCTTCTTCTAATAAATTATATTTATGTTTATTCCTTCATTTATTTCCATTAATTGCAATTATTTCAAAACTTGATATCTCATTATTTTAA ；
三花突蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:4所示:
TTGCTAAAACTAGTTTTAATCTCTCTCTTTAATTTCCATTTAAATAATCATACTATAATCTTTATTTCATCTTTAATTATTTTATTTATTTTATTAAAAATAACAAACTTTAATATATATGCTTATGATAATTATTTTTTTAATGATAATATTTCATTAATACTAATTACTTTAACCTTAATAAGATTTCTATTAATCATTATAGTCACAGACTATTTTAATAAAATGATTAAAACAATAATACCTATTATAATCACTCTTTTACTAGTTTTTTCTACAAGAAATATGTTATTATTTTATATTATATTTGAAATTGTTTTAATTCCTACTATAATTTTAATTATATCATTAGGTAAACAACCAGAACGATTACAAGCTAGAATTTACCTAATAGTATATACAATTGTAGCATCTTTACCTTTACTTATAGTTATTATTTTAATAATATTTAATAAATCATTTATAACCAATTTAATCTTATTAAATAATATTAATATAATACTCCCAATTATTATTGCCTTTTTAGTAAAAAGACCTATGTTTTTATCTCATTTATGATTACCCAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCGTAGAAGGGTCAATAATTCTCGCAGCAGTTTTATTAAAACTCGGCGGATATGGACTGATTCGATTTAGACCTCTTCTTTATGCCAAAATTATCCCATTAAACTTCTGAATTTCTAGAATCAGTTTAATTGGAGCAATTATAACAAGAATAAATTGTATCCGACAAAAAGATTTAAAATCTCTAATTGCTTACTCTTCAGTTGCCCATATAGGTCTAGTTCTAGCTAGAATTATAACCCTAAATTTCATCGGATTTTACGGAGCAATCTTAATAATAGTAGCCCATGGTCTATCCTCATCAGCCTTATTCCTAATAGTTAATATAATTTATACTAAACATCATACACGAAACATTATTTCATTTAAGGGTTTATGAAATTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGATTTGTCTTCATTGCAGCTAATATTTCCGCACCTCCTTCAATTAACTTAGCCGGAGAAATTTTTATTTTAATAAGTCTTATTAATTTAAATATTCTAATTCTAATCCCTTTTATTTTCATTTCATTAATAACTTCTATCTTTTCAATTACATTATTTTTAAACACAGTACATAACCAACCTAATTCTATTTTAGCTTCCTCTTCTTCTAATAAATTATATTTATGTTTATTCCTTCATTTATTTCCATTAATTGCAATTATTTCAAAACTTGATATCTCATTATTTT ；
横纹金蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:5所示:
ATAAAATTAGTCATCCCGATTATAACTTTAAGATTTTTATTTTTTAATTATGCTAATTATCTTATTATTTTATCATTCTCTATCCTTTTCATTTTTCTAAAACTTCCTTCCCTTCAAATATCAATTTTTAGAAAATTTATATTTAATGATTCAATCTCATTTATTATAATTTTACTTTCAATTATTAGAGTTATAATAATTATTATCTCTTCCTATACCTTAAAAAATTCTTTTGCTTTAACCACCTCCATTCTTTTAATTCTAATTTTAACCTTTTCTTCACTTAATATATTTTCATTTTATATACTATTTGAAATCGTTCTAATTCCAACATTATTTTTAGTAACCAAAATTGGTTATCAACCTGAACGCCTTCAAGCAGGTGTCTACTTAATAATTTACACAATTCTTGCCTCTTTACCCCTCTTATTAGGAATTTTATATTTTAAATATTCACCAAATTTTATTTTTCTTTCATCAAATTGTGAACAAATTAAAATTGCATTAATTTTTATTCTTGCTTTTTTAGTAAAAATACCCATATTTTTATTCCACCTTTGATTACCAAAAGCACACGTTGAAGCTCCCGTAGAAGGGTCAATAATTCTCGCAGCAGTTTTATTAAAACTCGGCGGATATGGACTGATTCGATTTAGACCTCTTCTTTATGCCAAAATTATTCCATTAAATTTTTGAATTTCTAGAATCAGTTTAATTGGAGCAATTATAACAAGAATAAATTGTATCCGACAAAAAGATTTAAAATCTCTAATTGCTTACTCTTCAGTTGCCCATATAGGTCTAGTTCTAGCTAGAATTATAACCCTAAATTTCATCGGATTTTACGGAGCAATCTTAATAATAGTAGCCCATGGTCTATCCTCATCAGCCTTATTCCTAATAGTTAATATAATTTATACTAAACATCATACACGAAACATTATTTCATTTAAGGGGCTATGAAATTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGATTTGTCTTCATTGCAGCTAATATTTCCGCACCTCCTTCAATTAATTTAGCCGGAGAAATTTTTATTTTAATAAGTCTTATTAATTTAAATATTCTAATTCTAATCCCTTTTATTTTCATTTCATTAATAACTTCTATCTTTTCAATTACATTATTTTTAAACACAGTACATAACCAACCTAATTCTATTTTAGCTTCCTCTTCTTCTAATAAATTATATTTATGTTTATTCCTTCATTTATTTCCATTAATTGTAATTATTTCAAAACTTGATATCTCATTAT ；
锥腹肖蛸卿癌因全序列如SEQ ID NO:6所示:
ATAAAAATTTTCTTATTATTCATGCCCCTATTAATATTTAATTCTAGATTTTATTTATTTTTATTATCTTCATCCATTTCTATATTATTTTATTTATTTTTTATTGTTAAAAATTTTAATACACAAATTACATCAAACTTAATAATAATAGACCCCTTATCAATATCCCTGACAATATTATCTTATTTAACTTTTATTATAATTTTTATATCCACAAATATAGATAAAGAAGCTAAATTATTATTATCTTTAATTTTAATTCTTTTAATTATTACATTTACACTGTCTAAGACAATAATATTTTATATTTTTTTTGAAATAATTTTAATCCCCACTCTCATTTTAATTACAAAAAAAGGTAACCAACCAGAACGCTTACAAGCAGGAATATATTTAATAATATATACTATTATTGCATCTCTTCCCCTCCTTCTTGCTATTTTATCTTATAAATCTTTAGAGTCCTTATTTTCTTCTTATCTTATAATTAAAAAAATTAATCTACCACTTATCTTTATACTAGCTTTTTTAGCCAAAACTCCTATATTTATAATTCACTTATGACTCCCTAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCTTAGAAGGGTCTATAGTTCTTGCTGCTATCCTTTTAAAATTAGGAGGATATGGTCTAATTCGATTTATCCCAATATCTCTACATTCCATAAAATCAATCCCACATTGAATTATTAGAATTAGAATAATAGGAGCAATTTTAACAAGATCAGGATGTATCCGTCAAAAAGATTTAAAAGCTTTAATTGCGTATTCATCTGTGGCCCACATGGCTGTCACCTTGTCAAGAATCATAATTTTTATAAAATCCTCTATAAATGGAGTAATCTTAATAATAATTGCTCACGGAATTTCATCCTCAGCTTTATTCTTTTTAGTTAATTTGACCTACAATAAATTTAATACCCGAAACACAATTAGATTGAAAAGAACCCAATTATCCCACCCTAATCTTACTTTCTGATGATTTATTTTTTCTATAATGAATATTAGAGCCCCACCCACCTTAAATCTAATAGGAGAGCTCCTTATATCAATAACCCTAATTAAATGACATATTATAAACGCCACAATTATTTTTATCATTACACTAATAACAACATCATTTTCTCTTTTAATTTTTCTAATACTTAATCATGGAAAATCTATAATAAAAATTTCTAAAAATGACCCAATAAAATTCTTTCTATCTTTAATAATCCACTTAGTTATATCAATTATAATCATTTTAAAAATAGAATTTATATTAATA ；
华丽肖蛸卿癌因全序列如SEQ ID NO:7所示:
TTGTCGAAAATTATAATAATAATAGTTTTTACTCTACTTACCAGAAATAGAATATATTTTTCTATAGCAATAATATCGTCTATTATAATTATAATCATAATTTTTTACAATAATATTTTAGATCTTCAAACATTAAATAGAATATTTATAATTGATTCCCTATCTTTAACTTTAATTCTCCTCTCTTCTATTACTTCTATTTTAATTATTATATCAACTAATATATTTTCATTTTCGAAAAAGATAATTATTATAATTTCATTAATTTTAATAATTACATTTTCAACATCCAAAACAATCATTTTTTATATTTTTTTTGAAATTGTCCTAATTCCTACAATAATTTTAATTACTAAAAGGGGAGCTCAACCCGAACGACTTAAAGCAAGAATATATCTTATTATATATACAATTTTAGCCTCTCTTCCCCTTCTTATTATTATTTTACTATGTAAATCTTGCGATGACTTCTTAAATGCCCCCATTACGATAAAAAAAATTGAAATTCCTCTATTATTTATAATAGCTTTTTTAGCTAAAACCCCAATGTTTATTATTCACATCTGACTTCCTAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCCTAGAGGGTTCAATAGTATTAGCAGCAGTCCTTCTTAAATTAGGAGGCTATGGAATAATTCGCTTTATTCCCCTATCCCTCTTCTCTTTAAAATTAATTCCCCATTGAATCTTAGCAATTAGAACAATGGGGGCGGTCTTCTCTAGAAGAGGGTGTTTACGTCAAAAAGATCTAAAAGCTTTAATTGCATATTCCTCAGTAGCTCATATAGCTATTACGTTGTCTAGAATCATAATTTTTTCTAAAACATCAATTAATGGGGCAATTATTATAATAATTGCCCACGGACTCTCCTCTTCAGCTTTATTTTTTTTAGTAAACTTAACCTATACTAAATTTCACACTCGAAATATAATTTCACTTAAAAGAATATTTTCTTCCAACCCTAACACAACATTTTGATGATTAATATTTTGCATAGCAAATATTAGAGCACCCCCATCTCTTAATTTAATTGGGGAATTATTAATATCTATAGCATTAATTAAGTGAAACATAATTTTATCCGTATTCATTATTATTATTACCCTATTAACTACCTCCTTTTGTGTTATTATATTCTTAATATTAAATCATGGCTCATCTATACTTAAAATTTCTAATAATGATTCTATAAAATTTTATATATCCCTATTTATTCACTTATTTATTTTAATTATAATTATCCTAAAAATAGAATTTATATTAGTG ；
茶色新圆蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:8所示:
ATAAAAATTATTTTTCCTTTAATAACAATAAGATTCTTTTTATTTAATTATATAAATTTTATAATTTTAAT
ATCAATTTCATCTTTTATTTTACTTTTAAAATTTTACTCTTTTAAACTATCTATTTTTAATAAATTTATATTTATA
GATCATCTTTCATTAATTATAATTTTATTATCATTTTTAAGAGTAATAATAATTATTATATCCTCTTATACATTAAAAAATTCTTATTTATTCATTTCATCAATTTTATTGATTCTTATTCTTACATTTTCTTCTAGAAATATATTTTCATTTTATATATTATTTGAACTAGTATTAATTCCCACATTACTTCTTATTACTAAAATTGGATATCAACCAGAACGATTACAGGCCGGGATTTACCTAATAATTTATACAATTATTGCATCACTCCCCCTTCTTCTAGGTATCCTATATTTTAAATATACTCCTAATTTCATTATTTTAAGATCAAACTGCGAACAAACTAAAACTATAATTATTTTTATTTTAGCCTTTTTAGTAAAAATGCCAATATTTTTATTTCATCTTTGATTACCTAAAGCACATGTAGAAGCCCCAGTAGAAGGATCAATAATTTTAGCTGCTGTTTTATTAAAATTAGGAGGATACGGATTAATTCGATTCTCACCTTTATTATATTCAAAATTTATTCCAATAAACTTTTGAATTTCAAGAATTAGTTTAATTGGAGCCATTATAACTAGAATAAATTGTATTCGACAAAAAGACTTAAAATCCTTAATTGCTTACTCTTCCGTCGCGCATATAGGATTAGTATTAGCAAGAATTATAACATTTAACTCAATTGGATTTTATGGAGCAATCTTAATAATATTTGCACATGGTATCTCTTCATCCGCCCTTTTCCTAATAGTTAATATAATTTATACAAAACACCACACCCGAAATATTATTTCTTTTAAGGGATTATGAAATTCATTTCCTAATATTACATTCTGATGATTTATTTTCATTGCAGCTAATATCTCTGCACCCCCATCTATTAATCTAGCAGGAGAAATCTTTATTCTTACAAGCCTAATCAACTTTAATATTTTAATTTTAATTCCATTCATTTTTATCTCACTAATAACTTCAATCTTTTCAATTTCATTATTTTTAAATACTTCACATAATCAAACTAATTCTAGGCTAGCATTAAACTCCTTTAATAAATTATATTTATGTTTATTTGCTCATCTTATTCCATTAGTCTTAATAATTTCAAAAATAGAAATATTCATAATATAA ；
脉娲蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:9所示:
TTGATAAAAATTACCCTACCACTTATATATTCATTATTATTAATAAATAATAACATTTCAACTATTATTATATTTTTATCTTGCATAATAATTACAATTCTACTTATTTTTAATCCAAAACACACTATTATTATTAGAAACACATTTATAATAGACAAATTTTCTATAATTTTAATTTTATTAACTCTAACAAGAATCCTACTAATTATATTCTCCTCTCAAAACATAAAAACAATTTCAAAAACAATTATTCCAATCTTCATTATTTTAATACTAACTTTCTCAGTTATAAGTATAATATTATTTTATATTTTATTTGAATTAGTATTAATTCCAACTATAATTTTAGTAATAAAATCAGGAAAACAACCTGAACGTCTACAAGCTAGAATTTATTTAATAGTATACACCATTACAGCCTCATTACCTTTATTAGTCAGAATCATTCTATTAAATTATAATCAATCTTTCATTATATCTTTTATAACAATAAACAAATTAAACATACCTATTCTATTTATATTGGCATTTTTAACAAAAATACCTATATTCTTTATACATCTTTGACTTCCCAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCCTAGAAGGTTCAATAATTCTAGCAGCTATTTTATTAAAACTAGGAGGATATGGTTTAATACGATTTATTCCCTTATGTATTTCCAAAATTAATAAAATCAACCATTGAATTATTAGAATTAGAATAATTGGTGCAACATGTACAAGACTTAACTGTATTCGACAAAAAGATTTAAAATCCTTAATTGCCTATTCATCAGTAGCTCATATAGCTCTAGTCTTACTAAGTATATTTACATTAAATTACATCGGATTAATAGGAGCTGTAATAATAATAATTGCCCATGGACTATCCTCATCCGCTTTATTCCTCCTAACAAATGACTTATACTCCAAATATCATACTCGTAACATCTCCTCCTTTAAAGGATTAATTAATTTATCTCCTAACATTACATTCTGATGATTTATATTTATAGCTATTAGTATCTCTGCTCCTCCATCAATTAATACAATTAGAGAAATTATAATTATATCAAGAATCATTTTATGAAATATGAAATCAATACTTTTAATTTTTATTATTTCCATCATAACTACCTCATTCTCAATAATAATATACTTAAACTTATCTCATAATAAAAATGAAATATTACCATCTAATCAATCATCAATAAAACTATTTACATCTTTATTCATTCATATAATTCCTTTAATCTTAATTCTATTCAAAATGGATTTAATAATTCTATATTCTATCTAG ；
黑色蝇虎卿癌因全序列如SEQ ID NO: 10所示:
ATAAAAATTGTACTCCCATCTTCATCTGTCATCATATTAATACTTATAAAATTTAATATTCTACCTTTATA
CATAATAATTATAATTCCTATCATTCTCACAATAATTTTAACTCTTAACATCAAATTTTCATTAATATCTATCTTA
TATATAATAGATCCTTTATCAATTATTATAATTCTACTAACTTTAATGAGAACTTTATTAATTTACCTCTCCTCATA
TAATCTAAAATATATTACTCCCACTATATCTTTAATTATAATTACATTGCTAATAACTTTTTTTTCAAAAAATATAT
TAATATTCTATATTATATTTGAGCTAGTATTAATTCCCACTATAATCTTAATTACCATAAATGGTAAACAACCAGAA
CGTCTTCAAGCCAGAATCTATTTAATTATTTATACAGTAACAGCTTCACTTCCACTACTAATAACAATTATTTTCACTCACTATAACAACTCATTTATATTTAGAAGAATTTCTATACTAAAATTTTCCATAGTAATCTTTATTATAATAGCCTTTCTAGTTAAAATACCTATATACTTAACACATTTATGATTACCAAAAGCTCATGTAGAAGCCCCTCTAGAGGGATCCATAATCCTAGCAGCTGTCTTATTAAAGCTAGGAGGATATGGAATTATTCGATTCATACCTTTATGTATTTCCACTATTAACAAAATTAACTTTTGAATTATTAGAATTAGATTAATCGGAGCTACCGCTACTAGAATAAATTGTATTCGACAAAAAGATTTAAAATCACTAATCGCTTATTCCTCTGTTGCCCATATAGGATTTGTTCTTACAGGATTATTTACATTAAACTATATCGGATTAATAGGATCAATTACAATAATAATCGCTCACGGACTAGCCTCCTCAGCTTTATTCTTATTAGTAAATGATTTATACTATAAATATCACTCTCGAAATATCTTAATATTTAAAGGACTATTAACACTAATACCTAATATTACCTTTTGATGATTTATATTTATAGCATTAAATATTTCCGCTCCTCCTACTATTAATACCTTAAGAGAAATTATAATAATATCAAGATTAATTTACTGAAATAATAATTCAATTATCATAATTTTCATAATATCCTTAATAACAGCTTCTTTCTCTTTAATAATATTTGTAAATATTATCCATAATAAAAATAATATATTACCTTCAATTAATACACCCCAAAAAATTTTTCTATCTTTATTTCTCCATTTTATTCCAACAGTAATAATAATTATAAAATTAGAAATAATCTCTTCCTAA ；
大腹园蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO: 11所示:
ATAAAACTTGTAATCCCTTTATTGACTATAAGATTCCTAATATTTAATTATTCAAATTTTTTAATTATTATATGTGTCTTAACAATATTTTTATTAACAAAATTTCATTCTTTTCAAATAATTATTTTTAATAAATTTATATTTACAGACTATATTTCTTTAATTATAATTATATTATCAATTATTAGAGTTATAATAATTATTATTTCTTCCTCTACACTAAATTATTCATTTTTACTCATTACATCTATTTTACTTACACTTATTCTTACTTTTTCATCTTTGAATATATTTTCCTTTTATATATTATTTGAAATTGTATTAATTCCAACATTACTTCTTATTACCAAAATCGGGTACCAGCCCGAACGACTTCAAGCTGGAATTTACTTAATAATTTATACTATCATTGCATCTCTTCCACTACTCTTAGGAATCTTATATTTCAAGTCCACACCCAATTTTATTTTCATTACCTCAACATGTGAACAAATTAAAATTACAATTATCTTTATTTTAGCTTTCCTAGTAAAAATACCAATATTTTTATTTCATTTATGATTACCTAAAGCTCATGTAGAAGCTCCAGTAGAAGGGTCAATAATTCTAGCCGCCGTTCTTTTAAAGCTTGGCGGTTACGGATTAATTCGATTTAGTCCCCTTTTATATTCAAAATTAATTCCCTTAAACTTTTGAATTTCAAGAATCAGATTAATTGGGGCAATTATAACAAGAATGAATTGTATTCGCCAAAAAGACCTTAAATCTCTTATTGCATATTCTTCTGTAGCCCATATAGGACTTGTCTTAGCAAGAATTACAACATTAAATTACATTGGGGTATATGGTGCTATCTTAATAATAGTAGCTCACGGATTATCATCCTCGGCTCTTTTTTTAATAGTAAATATAATTTATACAAAACATCATACTCGAAATATTATTTCGTTTAAGGGGTTATGAAGTTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGATTCATCTTTATCGCAGCCAATATCTCCGCACCCCCTTCTATTAACTTAGCAGGAGAAATCTTTATTTTAGTTAGATTAATTAATTGAAACTACTTCATTTTAATTCCATTTATTTTTATCTCTATTATAACTTCTATTTTTTCAATTTCATTATTTCTTAATACTACTCATAATCAGTCAAATTCCAAATTTGCAATATATTCTCATAATAAATTATACTTATGTTTATTTCTCCATCTATTCCCTCTCATCTTAGTTATTACTAAATTAGAACTAATTATATTTTAA ；
猫跳蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO: 12所示:
ATGTTAAATATATCCTTTACTTTAATATTTCCGCTATATATAATTATTAAACTCAACTCTACCTCCACATT
TATTATCATTATAACTTTACTAACCCTATTATTTTTAATAAAATTCAATAATAAATTTCCCATTATATCTCAATTC
CTATTACTAGACCACACCTCATTAATTATATTAATATTAACAACTACCAGAATTCTACTAATTATCCTTTCCACCTC
TCACTTATTATTAATTTCTAAAACAATCATCCCTATTCTAATTATTCTAATCATAACCTTTATATCAGATAATATTA
TTATATTTTATATTTTATTTGAAATAGTATTAATTCCAACAATATTTTTAATCACATTAAATGGTAAACAACCCGAA
CGACTCCAAGCTAGTATTTACTTAATCATTTATACAGTAACAGCTTCACTTCCTCTATTAATTAGTATTATTTGAAT
AAAATATAACTCTTCTTTCCTCTTTAATATTACATTATCATCTAAATTTTCAATAATTATCTTTATAATAATAGCCT
TTCTAGTTAAAATGCCTATATATTTAACACACCTATGACTACCAAAAGCTCATGTAGAAGCTCCTTTAGAAGGATCA
ATAATTTTAGCCGCTGTATTATTAAAATTAGGAGGATATGGTATCATTCGATTTTTACCATTATGCATTTCATCAAT
UL
oXVX3X3V3X0XX33V0VX3VVVVXVXXVVXXVXXXXVX3XX33XXV3XXXV3XXVVXXVXX33
XV3VXXXXXVVVVV3VXV3X3V0V3VXXX3XXX0XVXVXXVV0XVVVVV3VV3V3XXVXXVXVVVX0XXXVXVVX3V
XXX3X3XXX3X330X3VVXVVXXX3XVXVVX3XXXXXVVXXV0V30VV3XX0VVXVV0VV0X33X3XVXXVX0VX3X
VXVVXVVXVXXVVV0V0VVXV33VXVVXXVX3VX33X33X30V3XXXVXVVVXXV30VXVXXXVXV3XXV0XV0X3X
X33VVX0XVVX33VXVX3VV3VVXVVXXV00VVVXXXVXXXXVXXVXVVV0333VXV3XVXVVVVXV3VXVXXVV03
VVVX0VXXX333XXXX3330V3XX3XV3XVXXV003V3X30XXVVXVVXVXXVVXVXX0000VVV3XX000XXVV3X
XVV3XXX3VXXX0X3X0VV3VVX3VX03XXV00VXV3V3X30VX0V3XX3XXVXX30XXVVX3X3XVVVVX3XV0VV
【权利要求】
1.一种蜘蛛线粒体ND4基因全序列扩增引物，其特征在于:正向引物ND4-F如SEQID NO:1所示，反向引物ND4-R如SEQ ID NO:2所示，
SEQ ID NO:1: 5' -CCTAATCCATCTCAACCTA-3';
SEQ ID NO:2: 5' - TTCTAGTCTTAATAGTAT-3'。
2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的设计方法为:登陆NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的蜘蛛线粒体全基因组序列，经ClustalX同源比对,在ND4基因上下游找出保守的序列,利用Premier primer 5.0软件设计出蜘蛛线粒体ND4基因全序列扩增引物。
3.一种基于如权利要求1所述扩增引物的蜘蛛种类鉴定方法，其特征在于该方法按以下述步骤进行:(I) DNA抽提试剂盒法提取蜘蛛的总DNA; (2)设计蜘蛛线粒体癌因全序列的扩增引物；(3)以蜘蛛总基因组DNA为模板，进行PCR扩增；(4)扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收广增片段，测序；依据全序列信息快速确定蜘蛛的种类。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中为避免蜘蛛肠道内容物的污染，舍去头腹部，只从其腿部提取DNA。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中蜘蛛种类包括:拟水狼蛛，三突花蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛾，华丽肖蛾，茶色新圆蛛，脉娲蛛，黑色蝇虎，大腹园蛛，猫跳蛛。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的扩增引物为:正向引物ND4-F如SEQ NO:1所示，反向引物ND4-R如SEQ NO: 2所示。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤⑶的PCR反应体系为50μ 1，其中:2μ I 模板 DNA，5yl 10XPCR buffer, 4μ I 2.5 mM MgCl2,1 μ I 10 mMdNTPs，各Ιμ? 10 mM正、反向引物，0.5μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ I ;PCR反应条件如下:95° C预变性5分钟，94° C变性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸I分钟；35个循环后，72° C再延伸7分钟。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中凝胶电泳采用1.5%琼脂糖凝胶电泳；根据全基因序列碱基信息进行蜘蛛种类鉴定。
【文档编号】C12Q1/68GK104450698SQ201410753746
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】俞晓平, 王正亮, 李超 申请人:中国计量学院