一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库、构建方法及用途
【专利摘要】本发明公开一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，由以下制备步骤得到：采取未经免疫任何抗原的双峰驼的血样和脾脏，提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增VHH；使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切pMECS噬菌体展示载体及VHH并连接两个片段；将连接产物电转化至感受态细胞TG1中。本发明还公开其构建方法及在筛选针对PCT和NAGL的纳米抗体方面的应用。本发明构建的天然噬菌体展示文库能够筛选获得具有特异性和检测功能的纳米抗体，可以解决由于抗原因素造成无法免疫骆驼导致无法构建相应噬菌体展示文库而无法得到纳米抗体的问题，同时这样的文库也能解决免疫骆驼耗时较长的问题。
【专利说明】一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库、构建方法 及用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学或生物制药【技术领域】，具体涉及一种天然的双峰驼源噬菌体 展示纳米抗体文库、构建方法及用途。
【背景技术】
[0002] 从免疫文库筛选纳米抗体是获得纳米抗体最为广用的方法。由免疫过的骆驼产生 的纳米抗体文库能够保持完整的多样性。尽管高亲和力的纳米抗体可以在短时间内筛选获 得，但在某些情况下，无法实现骆驼免疫，例如免疫原具有高毒性、致病性或传染性，蛋白错 误折叠形成包涵体而无法得到可溶性抗原，抗原自免疫性以及当抗原是不具有免疫性的小 分子化合物等。
[0003] 降I丐素原（Procalcitonin，PCT)，是一种蛋白质，体内参考值为〈0· 5ug/L。当严 重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免 疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导 致其升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。另外，PCT只是在少数患者的大型外科术 后1?4d可以测到。PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征和多器官功 能紊乱综合征，即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些病例中PCT水平通常低于那 些有细菌性病灶的患者。
[0004] 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)，是Iipocalin家族的新成员，是脂质运载蛋白家族的一个新成员，它是 肾功能损伤早期的生物标志物。NGAL是铁粒子鳌和/转运体，急性肾小管损伤早期表达。 虽然结构尚不清，但被认为参与缺血再灌注损伤修复过程，可能与肾小管内皮再生有关。最 近研究表明NGAL是肾损伤的敏感指标。对肾移植病人的研究表明尿中NGAL增加可预测移 植肾功能恢复延迟，而且比血清肌酐增加的预测作用快近24小时。对心脏手术病人前瞻性 研究发现术后1小时尿NGAL明显增加。研究表明NGAL可能与炎症反应、肿瘤发展、肾脏疾 病有一定关系。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库、构建方法及在 筛选针对PCT和NAGL的纳米抗体方面的应用。
[0006] 本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面，提供了一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，由以 下制备步骤得到：采取未经免疫任何抗原的双峰驼的血样和脾脏，提取总的mRNA，反转录 成cDNA，利用套式PCR扩增VHH ;使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切pMECS噬菌体展 示载体及VHH并连接两个片段；将连接产物电转化至感受态细胞TGl中，构建天然的双峰驼 源噬菌体展示纳米抗体文库。
[0008] 优选地，所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，由以下制备步骤得到：采 取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取IOOmL,另外取1只未经免疫任何抗原的 双峰驼的脾脏，提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增VHH ;使用限制性的内切 酶Pst I及Not I酶切96 μ g pMECS噬菌体展示载体及32 μ g VHH并连接两个片段；将连 接产物电转化至感受态细胞TGl中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，其库 容的大小为6. 86X 10nCFU/mL。
[0009] 本发明第二方面，提供了所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建方 法，操作步骤如下：采取未经免疫任何抗原的双峰驼的血样和脾脏，血样中分离淋巴细胞并 碾磨脾脏，从淋巴细胞和碾磨的脾脏中提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增 VHH ;使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切pMECS噬菌体展示载体及VHH并连接两个片 段；将连接产物电转化至感受态细胞TGl中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文 库。
[0010] 优选地，所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建方法，操作步骤 如下：采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取IOOmL,另外取1只未经免疫 任何抗原的双峰驼的脾脏，血样中分离淋巴细胞并碾磨脾脏，从淋巴细胞和碾磨的脾脏 中提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增VHH ;使用限制性的内切酶Pst I及 Not I酶切96 μ g pMECS噬菌体展示载体及32 μ g VHH并连接两个片段；将连接产物电转 化至感受态细胞TGl中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，其库容的大小为 6. 86X10nCFU/mL。
[0011] 优选地，所述套式PCR扩增VHH其第一步PCR的正向引物如SEQ ID NO :1所示，反 向引物如SEQ ID NO :2所示；其第二步PCR的正向引物1如SEQ ID NO :3所示，正向引物2 如SEQ ID NO :4所示，反向引物如SEQ ID NO :5所示。
[0012] 本发明第三方面，提供了所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体 展示方法筛选PCT或NGAL纳米抗体中的应用。
[0013] 优选地，所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体展示方法筛选 PCT或NGAL纳米抗体中的应用，其筛选出的PCT纳米抗体的VHH链其氨基酸序列如SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8所示；筛选出的NGAL纳米抗体的VHH链其氨基酸序列 如 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11 所示或 SEQ ID NO :12 所示。
[0014] 本发明第四方面，提供了所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体 展示方法筛选出的PCT或NGAL纳米抗体在检测PCT或NGAL方面的应用。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血清获取骆驼淋巴血细胞和另1 只未经免疫任何抗原的双峰驼的脾脏，提取总的mRNA，从而建立天然的纳米抗体基因库。 同时，试验中将PCT和NGAL分别偶联在酶标板上，以此形式的PCT和NGAL利用噬菌体展 示技术筛选构建纳米抗体基因库，从而获得了针对PCT和NGAL特异性纳米抗体基因，将此 基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。本发明构建 的天然噬菌体展示文库能够筛选获得具有特异性和检测功能的纳米抗体，可以解决由于 抗原因素造成无法免疫骆驼导致无法构建相应噬菌体展示文库而无法得到纳米抗体的问 题，同时这样的文库也能解决免疫骆驼耗时较长的问题。这样的噬菌体展示文库的库容为 6. 86X 10nCFU/mL，质量很好，多样性丰富，将作为纳米抗体获得的有力资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是天然的纳米抗体文库构建的模式图。
[0018] 图2是纳米抗体的基因电泳图。
[0019] 图3是对所建文库的库容大小进行鉴定的梯度稀释涂板图。
[0020] 图4是是对于所构建的文库进行插入率检测的菌落PCR电泳图。
[0021] 图5是表达的针对PCT的纳米抗体。
[0022] 图6是表达的针对NGAL的纳米抗体。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1 :天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建：
[0024] (1)采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取IOOmL,同时，杀死另1 只未经免疫任何抗原的双峰驼，将其脾脏取下。从血样中分离淋巴细胞，同时将脾脏碾磨。 再从淋巴细胞和碾磨的脾脏中提取总的mRNA。（2)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH，结 果如图2显示。（3)使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切96 μ g pMECS噬菌体展示载 体（Biovector供应）及32 μ g VHH并连接两个片段。（5)将连接产物电转化至感受态细胞 TGl(北京神州红叶科技有限公司）中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库并测 定库容，库容的大小为6. 86 X 10nCFU/mL，图3显示当稀释倍数为IO8时，克隆数量约为98 颗；与此同时，随机挑取24颗克隆，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果插入率为 100%，图4显示菌落PCR结果。
[0025] 利用套式PCR扩增VHH的具体条件如下：
[0026] 第一步PCR程序：
【权利要求】
1. 一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，其特征在于，由以下制备步骤得到： 采取未经免疫任何抗原的双峰驼的血样和脾脏，提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式 PCR扩增VHH ;使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切pMECS噬菌体展示载体及VHH并连 接两个片段；将连接产物电转化至感受态细胞TG1中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳 米抗体文库。
2. 根据权利要求1所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，其特征在于，由 以下制备步骤得到：采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取100mL，另外取1 只未经免疫任何抗原的双峰驼的脾脏。提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增 VHH ;使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切96 y g pMECS噬菌体展示载体及32 y g VHH 并连接两个片段；将连接产物电转化至感受态细胞TG1中，构建天然的双峰驼源噬菌体展 示纳米抗体文库，其库容的大小为6. 86X 10nCFU/mL。
3. 权利要求1所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建方法，其特征在 于，操作步骤如下：采取未经免疫任何抗原的双峰驼的血样和脾脏，血样中分离淋巴细胞并 碾磨脾脏，从淋巴细胞和碾磨的脾脏中提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增 VHH;使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切pMECS噬菌体展示载体及VHH并连接两个片 段；将连接产物电转化至感受态细胞TG1中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文 库。
4. 权利要求2所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建方法，其特征在 于，操作步骤如下：采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取100mL，另外取1 只未经免疫任何抗原的双峰驼的脾脏，血样中分离淋巴细胞并碾磨脾脏，从淋巴细胞和碾 磨的脾脏中提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增VHH ;使用限制性的内切酶 Pst I及Not I酶切96 y g pMECS噬菌体展示载体及32 y g VHH并连接两个片段；将连接 产物电转化至感受态细胞TG1中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，其库容 的大小为 6. 86X 10nCFU/mL。
5. 根据权利要求3或4所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建方法， 其特征在于，套式PCR扩增VHH其第一步PCR的正向引物如SEQ ID N0:1所示，反向引物如 SEQ ID NO :2所示；其第二步PCR的正向引物1如SEQ ID NO :3所示，正向引物2如SEQ ID NO :4所示，反向引物如SEQ ID NO :5所示。
6. 权利要求1或2所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体展示方法 筛选PCT或NGAL纳米抗体中的应用。
7. 根据权利要求6所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体展示方 法筛选PCT或NGAL纳米抗体中的应用，其特征在于，筛选出的PCT纳米抗体的VHH链其氨 基酸序列如SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8所示；筛选出的NGAL纳米抗体的 ￥冊链其氨基酸序列如3￡〇10勵：9、3￡〇10勵：10、3￡〇10勵：11所示或3￡〇10勵：12 所示。
8. 权利要求7所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体展示方法筛 选出的PCT或NGAL纳米抗体在检测PCT或NGAL方面的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104404630SQ201410762748
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】万亚坤, 严俊荣, 朱敏 申请人:东南大学