VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用。本发明公开一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.15所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明证明，VdUDG基因是微菌核形成过程中的必要因子，VdUDG基因在大丽轮枝菌致病、微菌核形成和产孢过程中起重要作用。本发明推动了棉花黄萎菌的致病机理的研究，最终为开发黄萎病的防治新策略提供理论依据。
【专利说明】VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病是一种土传的维管束系统病害，是由大丽轮枝菌引起的，其对棉花的 生产造成了严重的危害。自1935年，棉花黄萎病随着棉花种子的引进，而传入我国，随后便 开始逐渐蔓延全国。尤其从20世纪90年代以后，棉花黄萎病在我国扩展蔓延极为迅速，其 中1993年棉花黄萎病最为严重，发病面积达266. 67万hm2,随后在1995、1996、1999、2000、 2002、2003年全国范围内连续爆发，损失十分严重，棉花黄萎病已对我国棉花生产以及可持 续发展构成极大威胁。
[0003] 棉花黄萎病是由半知菌亚门（Deutermycotina)淡色菌科（Mmonilaceae)轮 枝菌属（Verticillium)真菌引起，属内有若干个种，其中危害棉花的有大丽轮枝菌 (V. dahliae)、黑白轮枝菌（V. albo-atum)两个种。我国棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引 起的。大丽轮枝菌没有寄主专化性，可以危害多种植物，从一年生的草本植物到多年生的木 本植物。大丽轮枝菌可以形成一种叫做黑色微菌核的休眠结构，可以在缺乏寄主的土壤中 存活长达数年。
[0004] 大丽轮枝菌主要以分生孢子、菌丝体和黑色微菌核越冬，微菌核作为其最主要的 初侵染来源，在受到植物根部分泌物的刺激时便会萌发。菌丝一般从植物根部侵入，随着植 物的蒸腾作用向植物的茎叶中扩展、定植，最终侵染整个植株。一般被大丽轮枝菌侵染过得 植株都会表现出萎蔫，干枯，叶脉失色，坏死等症状，维管束变褐是黄萎病最典型的症状。
[0005] 田黎等的研宄认为棉花黄萎病的发生发展与土壤中微菌核的数量密切相关。大丽 轮枝菌微菌核的多少通常与其致病力和抗逆性有关。有研宄显示，土壤里面棉花黄萎菌微 菌核一旦达到0. 03个/g，就会导致棉花出现萎蔫症状，当土壤中微菌核含量达到0. 3个/ g?I. 0个/g时，就会有20%?50 %的棉花植株发病，当土壤中微菌核含量达到3. 5个/ g以上，棉花植株都会发病。另有研宄表明，0.5个/g土为引起棉花发病的临界值。在田里 面，当黄萎菌侵染莴苣后，土壤中的微菌核数量为至少50个/g，而病害很重的田块，微菌核 数目高达2400个/g。
[0006] USER(Uracil Specific Excision Reagent)克隆使多片段直接克隆到载体上成 为可能。USER体系依赖于USER酶，是一种尿嘧啶特异性切割酶，USER酶主要是靠尿嘧啶 DNA糖基化酶（UDG)和核酸内切酶VII (DNA糖基化酶-裂解酶）共同起作用。经过USER酶 处理过的载体正好3'端正好有一个缺口，与用In-Fusion克隆得到的PCR产物正好匹配，便 会组装成一个重组分子。相对In-Fusion方法，USER克隆整合效率要高很多，大概为80% (In-Fusion 整合效率为 10-20% ) 〇
[0007] 棉花是目前世界上种植面积最大的工业原料作物，在我国是仅次于粮食的第二大 农作物。棉花黄萎病是目前我国棉花生产过程中最具毁灭性的真菌病害。由于至今尚未研 制出效果显著的防治药剂和抗病品种，被称为棉花的"癌症"，因此如何控制黄萎病的猖獗 危害，已成为棉花生产可持续发展的关键问题。在这种情况下，研宄大丽轮枝菌的致病机 理，了解大丽轮枝菌与寄主的互作机理就显得更为重要。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种VdUDG基因及其在降低大丽轮枝菌致病性中的应用。
[0009] 本发明提供一种蛋白，为如下⑴或（2)所示：
[0010] (I)SEQ ID No. 15 所示的蛋白；
[0011] ⑵将SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0012] 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0013] 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
[0014] I) SEQ ID No. 14 所示的 DNA 分子；
[0015] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0016] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA 分子。
[0017] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。
[0018] 一种防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病的方法也属于本发明的保护范围，是将大 丽轮枝菌的VdUDG蛋白的编码基因突变；
[0019] 所述VdUDG蛋白为上述蛋白；
[0020] 所述植物具体为棉花。
[0021] -种降低大丽轮枝菌致植物黄萎病能力或大丽轮枝菌微菌核形成能力的方法也 属于本发明的保护范围，是将VdUDG蛋白的编码基因突变；
[0022] 所述VdUDG蛋白为上述蛋白。
[0023] -种提高大丽轮枝菌产孢能力的方法也属于本发明的保护范围，是将VdUDG蛋白 的编码基因突变；
[0024] 所述VdUDG蛋白为上述蛋白。
[0025] 上述任一所述的方法中，所述突变为敲除突变或插入突变。
[0026] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病中的应 用也属于本发明的保护范围；
[0027] 或，
[0028] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在开发或筛选防治大丽轮枝菌导致的植物黄 萎病的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0029] 所述广品能抑制上述蛋白的表达。
[0030] 所述植物具体为棉花。
[0031] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在降低大丽轮枝菌致植物黄萎病能力或大丽 轮枝菌微菌核形成能力中的应用也属于本发明的保护范围；
[0032] 所述植物具体为棉花。
[0033] 或，
[0034] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在提高大丽轮枝菌产孢能力中的应用也属于 本发明的保护范围。
[0035] 本发明证明VdUDG基因敲除的大丽轮枝菌即使在极端营养缺陷型培养基上也不 产生黑色微菌核，但白色气生菌丝生长旺盛，产孢高于野生型大丽轮枝菌，并且与野生型大 丽轮枝菌相比，对棉花的致病性下降。
[0036] 进一步实验结果显示，VdUDG基因的突变导致微菌核形成过程中的重要阶段，泡 囊形成受阻，从而造成大丽轮枝菌完全丧失微菌核的形成功能。通过对VdUDG的表达分析 可以看出，该基因在微菌核中高表达，在孢子中表达量较少而在菌丝中不表达，进一步暗 示了 VdUDG基因在微菌核形成过程中发挥了至关重要的作用.
[0037] 通过进一步构建互补载体VdUDG: :pSULPH-mut-RG#PB，通过根癌农杆菌介导的遗 传转化（ATMT)方法整合到VdUDG基因敲除突变体Vdudg中，成功的获得了互补转化子。经 过培养性状观察，结果显示互补转化子与敲除突变体相比，气生菌丝不是很发达，产生了大 量的黑色微菌核。这说明VdUDG基因在微菌核形成过程中确实发挥了至关重要的作用。
[0038] 本发明证明，VdUDG基因是微菌核形成过程中的必要因子，VdUDG基因在大丽轮枝 菌致病、微菌核形成和产孢过程中起重要作用。本发明推动了棉花黄萎菌的致病机理的研 宄，最终为开发黄萎病的防治新策略提供理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1为敲除载体PRF-HU2质粒示意图。
[0040] 图2为互补载体双元质粒载体pSULPH-mut_RG#PB示意图。
[0041]图3为敲除载体的构建策略图。
[0042] 图4为敲除突变体的验证。
[0043] 图5为VdUDG基因在野生型V592各组织中的表达分析。
[0044] 图6为敲除突变体生物学性状观察结果。
[0045] 图7为敲除突变体在洋葱表皮上侵入过程。
[0046] 图8为敲除突变体的致病性检测。
[0047] 图9为Vdudg全长基因的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0048] 图10为互补转化子和敲除突变体的表型检测。
[0049] 图11为T-DNA插入突变体菌株的表型及其致病性鉴定结果。
[0050] 图12为插入突变体中T-DNA插入拷贝数分析。
[0051] 图13为插入突变体dl37中T-DNA在基因组中的插入位置分析。
【具体实施方式】
[0052] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0053] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054] 棉花黄萎病菌株大丽轮枝菌（V. dahliae)野生型菌株V592在文献"彭姗，吕学莲， 高峰等.一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008, 20 (3): 174? 178. "中公开过，公众可从石河子大学获得。
[0055] pMD18_T 为 Takara 产品。
[0056] 敲除载体 pRF_HU2 在文献 "Ronnie de Jonge，Η· Peter van Esse，Karunakaran Maruthachalam， et al.Tomato immune receptor Velrecognizes effector of multiple fungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing[J]. PNAS，2012, 4(27) :5110?5115. "中公开过，公众可从石河子大学获得，该载体上有任何真 菌生物基因组中没有的两个酶切位点PacI和Nt. BbvCI，还含有真菌选择性标记一潮霉素 标记和细菌选择性标记一卡那霉素（Kan)标记，该载体的示意图如图1所示。
[0057] 互补载体双元质粒载体pSULPH-mut-RG#PB的序列如SEQ ID No. 1所示，该载体含 氯嘧磺隆抗性基因和真菌的表达启动子ToxA和终止子NOS ter，且为卡那霉素抗性，该载 体的示意图如图2所示。
[0058] 根癌农杆菌 EHA105 在文献"Gao，Bang-Jun Zhou，Guo_Ying Li，et al. A Glutamic Acid-Rich Protein Identified in Verticillium dahliae from an Insertional Mutagenesis Affects icrosclerotial Formation and Pathogenicity[J]. PLos One，2010, 12 (5). "中公开过，公众可从石河子大学获得。
[0059] 抗生素溶液的配制：
[0060] ①潮霉素（Hyg，罗氏公司）工作浓度为100 μ g/mL，头孢霉素（Cef)工作浓度为 300 μ g/mL，卡那霉素（Kan)工作浓度为50 μ g/mL，利福平（Rif)工作浓度为10 μ g/mL ;
[0061] ②乙酰丁香酮（AS，IOmM) IOmL :称取19. 62mg乙酰丁香酮，用IOmL蒸馏水溶解，大 约要搅拌一小时，全部溶解以后，用5M KOH调节pH到8,过滤灭菌以后保存到-20°C。
[0062] ③2-N-玛琳乙磺酸（MES，1M) IOOmL :称取19. 52g MES用80mL蒸馏水溶解完全以 后，用5M KOH调节pH到5. 3,然后定容至IOOmL并用过滤器过滤灭菌最后-20°C保存。
[0063] 10 %的甘油（v/v) IOOmL : IOmL纯甘油，90mL蒸馏水混匀。
[0064] 20%甘油卜八）10〇1^:2〇1^纯甘油，8〇11^蒸馏水混匀。
[0065] 50mM的L-天冬酰胺IL :溶解6. 6g L-天冬酰胺到IL蒸馏水中，过滤灭菌。
[0066] 200 X Trace solution for Vogels salts，1L: 5g 朽1 樣酸，5g ZnSO4 · 7H20, Ig Fe (NH4)2 (SO4) 2.6H20,0.25g CuSO4 .5H20,0.05g MgSO4 .H20,0.05g H3B03,0.05g Na2Mo O4 · 2H20, IOOOmL蒸馏水，过滤灭菌。
[0067] 50 X Vogels salts，IL : 125g C6H9Na3O9, 250g KH2P04, 9. 3g MgSO4 · 6H20, 5g CaCl2 · 2H20,5mL 200XTrace solution IOOOmL 蒸馈水，过滤灭菌。
[0068] I, OOOXTrace elements for DFM medium, IL ：40mg Na2B4O7* IOH20,400mg CuSO4 · 5H20,1. 2g FeSO4 · 7H20,700mg MnSO4 · H20,800mg Na2MoO4 · 2H20, IOg ZnSO 4 · 7H20， IOOOmL蒸馏水，过滤灭菌。
[0069] 2· 5X Salt solution IL :3. 625g ΚΗ2Ρ04,5· 125g Κ2ΗΡ04,0· 375g NaCl，I. 160g MgSO4 · 6H20,0. 165g CaCl2 · 2H20,0. 0062g FeSO4 · 7H20,1. 250g (NH4)2SO4,1，OOOmL 蒸馏水， 过滤灭菌。称取以上物质需称取一个溶解一个避免形成不溶物。
[0070] RA 培养基 IL :50g 丁 二酸钠（C4H4O4Na2 · 6H20)，12. Ig NaNO3, 20mL 50XVogels salts ( - N, - C)，950mL蒸馏水，高压灭菌，在用之前加上50mL灭过菌的20g/100ml的葡萄 糖水溶液。
[0071 ] 水琼脂IMAS培养基300mL :将6g琼脂粉和146mL蒸馏水混合在300mL瓶子里，高 压灭菌保存。用的时候微波炉融化后加入IMS培养基的其他成分。
[0072] IMAS 固体培养基 300mL :120. OmL 2. 5 X Salt solution (60 °C 预 热），7mL20g/100ml的葡萄糖水溶液，7. 5mL 20%甘油（v/v)混合到融化的水琼脂IMAS中 (最终琼脂粉的浓度为2g/100ml).待混合液冷却至55°C加入12. OmL MES (IM)，6. OmL乙酰 丁香酮（IOmM)。
[0073] IMAS 液体培养基的配制 152. 5mL :120. OmL 2. 5 X Salt solution (60°C预热），7mL 20g/100ml 的葡萄糖水溶液，7.5mL 20% 甘油（v/v)，12.0mL MES(lM)，6.0mL 乙酰丁香酮 (IOmM)〇
[0074] 水琼脂DFM培养基500mL :将IOg琼脂粉和358mL蒸馏水混合在500mL瓶子中，高 压灭菌保存。用的时候微波炉融化后加入DFM培养基的其他成分。
[0075] DFM 固体培养基 500mL :31. 25mL 20g/100ml 的葡萄糖水溶液，100. OmL 50mM L-天 冬酰胺（60°C预热），5.0mL 210mM MgS04,5.0mL L12M KH2P04+0.7M KCL(pH 6)，0.5mL 1，OOOXTrace elements混合到融化的水琼脂DFM中（琼脂的终浓度为2g/100ml).待冷却 到55°C加入所要求的抗生素。
[0076] 供试棉花品种108夫（Gossypium hirsutum L.)在文献"彭姗，吕学莲，高峰等·一 种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研宄[J].棉花学报，2008, 20 (3) : 174?178. "中公 开过，公众可从石河子大学获得，该品种棉花为高感黄萎病棉花品种。
[0077] 1 %水琼脂培养基IOOmL:将Ig的琼脂粉和99mL的蒸馏水混匀在200mL的三角瓶 中，高压灭菌保存。
[0078] 实施例1、农杆菌pRF_HU2: : Dgene的制备
[0079] 一、质粒的线性化
[0080] PacI和Nt. BbvCI双酶切pRF-HU2得到载体pRF-HU2的两个线性化片段。
[0081] 二、敲除同源臂的获得
[0082] (一）引物设计和合成
[0083] 设计和合成如表1所示的引物。
[0084] 表1引物序列
[0085]
【权利要求】
1. 一种蛋白，为如下（1)或（2)所示： (1) SEQ ID No. 15所示的蛋白； (2) 将SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种： 1. SEQ ID No. 14 所示的 DNA 分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5. -种防治大丽轮枝菌导致的植物黄萎病的方法，是将大丽轮枝菌的VdUDG蛋白的编 码基因突变； 所述VdUDG蛋白为权利要求1所述的蛋白； 所述植物具体为棉花。
6. -种降低大丽轮枝菌致植物黄萎病能力或大丽轮枝菌微菌核形成能力的方法，是将 VdUDG蛋白的编码基因突变； 所述VdUDG蛋白为权利要求1所述的蛋白。
7. -种提高大丽轮枝菌产孢能力的方法，是将VdUDG蛋白的编码基因突变； 所述VdUDG蛋白为权利要求1所述的蛋白。
8. 根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述突变为敲除突变或插入突变。
9. 权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在防治大丽轮枝菌导致的 植物黄萎病中的应用； 或， 权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在开发或筛选防治大丽轮枝 菌导致的植物黄萎病的产品中的应用； 所述广品能抑制权利要求1所述的蛋白的表达； 所述植物具体为棉花。
10. 权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在降低大丽轮枝菌致植物 黄萎病能力或大丽轮枝菌微菌核形成能力中的应用； 所述植物具体为棉花； 或， 权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在提高大丽轮枝菌产孢能力 中的应用。
【文档编号】C12N15/56GK104480085SQ201410765421
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】高峰, 张燕玲, 张婷 申请人:石河子大学