水貂细小病毒病毒样颗粒及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供的水貂细小病毒病毒样颗粒，其是根据昆虫细胞偏爱密码子，对水貂细小病毒VP2基因进行优化，将优化后VP2基因的5′端直接与编码部分多角体蛋白的核苷酸序列相连，然后克隆至转移载体中，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产水貂细小病毒病毒样颗粒。利用该表达系统可安全、高效、大规模的生产水貂细小病毒病毒样颗粒，且所得病毒样颗粒滴度高、免疫原性好，肌肉免疫和口服免疫均可诱导水貂机体产生高水平的特异性抗体，并可抵抗强毒的攻击，对水貂提供很好的保护作用，为制备水貂病毒性肠炎疫苗奠定基础。
【专利说明】水貂细小病毒病毒样颗粒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及水貂 细小病毒病毒样颗粒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 水紹病毒性肠炎是由水紹肠炎细小病毒（Mink enteritis viurs, MEV)引起的一 种烈性传染病，又称传染性肠炎或称为泛白细胞减少症，猫科、鼬科、貂科和犬科动物均易 感，是对水貂饲养业危害较大的三大病毒性传染病之一。该病最早由Schofield于1949年 发现于加拿大威廉堡某水貂养殖场，1952年，Will提取了病原，命名为MEV。随后，此病迅 速蔓延至美国、丹麦、挪威、瑞典、苏联、日本等许多国家。我国于1974年首次发现该病，此 后蔓延至全国，给水貂养殖业带来巨大经济损失。
[0003] MEV属于细小病毒科（Parvoviridae)细小病毒属（Parovirus)，是目前发现的动 物病毒中形态最小、结构最简单的一类单链线状病毒之一。病毒粒子有呈二十面体对称结 构的核衣壳，无囊膜，直径大小为20-25nm。基因结构为单链DNA，含有两个主要的开放阅读 框（Open Reading FramesJRFshS'端 ORFs 编码非结构蛋白 NSl 和 NS2,3^ 端 ORFs 编码 结构蛋白VPl和VP2, VP2是构成病毒衣壳的主要蛋白。
[0004] 水貂病毒性肠炎传染性强，病情恶化迅速，主要表现为呕吐、腹泻下痢、精神沉郁、 胃肠粘膜出血等病症。断奶仔貂、3-6月龄幼貂最易感染，死亡率高达60%-90%。不论品 种和年龄的水貂，均对MEV易感，只是发病率不同。成年貂对此病的抵抗能力较强，不表现 出特别强烈的临床症状，一般为隐形感染或是慢性经过，发病率较低，一旦确诊，致死率也 会达到80%。发病的水貂作为主要的病毒传染源向外辐射，进而感染缺乏抵抗力的其他水 貂。
[0005] 对于此类疾病来说，防大于治。预防MEV最有效的手段是定时接种疫苗。目前国内 外使用较多的是灭活苗和弱毒苗，预防效果较好，如MEV组织培养福尔马林灭活疫苗，MEV 同源组织灭活苗，MEV同源组织灭活苗与肉毒梭菌类毒素二联苗，犬瘟热、病毒性肠炎、肉毒 梭菌类毒素、假单胞菌四联苗等。缺点是灭活疫苗的免疫效力相对较低，弱毒疫苗存在毒力 返祖的潜在危险性，还有不稳定、不易于保存和运输等缺点。随着分子生物学技术的不断进 步，多种基因工程疫苗已被研发，如亚单位疫苗、表位疫苗及合成肽疫苗等，相对于传统疫 苗具有安全、稳定的特点。Langeveld J D等研制的合成肽疫苗和表位疫苗具有很好的保护 水貂抵抗MEV感染的效果。Dalsgaard K等应用豇豆花叶病毒-植物细胞表达系统成功表 达了 MEV VP2蛋白。
[0006] 多角体蛋白（Polyhedrin，polh)基因由245个氨基酸组成，是多角体的主要结构 成分。多角体保护包埋其中的病毒粒子，使其免受物理和生化降解，保持病毒粒子在自然环 境中的感染能力。多角体蛋白在病毒感染细胞后极晚期才高效表达，当其它病毒基因和宿 主基因关闭后，在病毒感染的极晚期，此基因能持续高水平表达，多角体蛋白在细胞内的产 量可达细胞蛋白质总量的25% -50%。丁鑫鑫将家蚕杆状病毒的polh融合于破骨细胞形 成抑制因子（Osteoprotegerin，OPG)中，分别在大肠杆菌和家蚕细胞BmN内表达。结果表 明，融合蛋白Polh-OPG在大肠杆菌中表达量明显提高，但融合蛋白在家蚕细胞中的表达差 异不明显。郭爱芹构建了一系列带有多角体启动子和不同长度polh基因片段的新型供体 质粒，并以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因，发现在BmN细胞中，多角体蛋白融合表达策略 可显著提高外源蛋白的表达水平。而将多角体蛋白的4个氨基酸序列融合表达于水貂细小 病毒VP2中，在草地贪夜蛾卵巢细胞（Sf9细胞）中能否高水平表达外源蛋白，外源蛋白可 否正确包装成病毒样颗粒，且其免疫原性和反应原性的高低等，目前尚无文献支持。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供水貂细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合蛋白，由部分多角体蛋白序列融 合表达于水貂细小病毒VP2蛋白N端组成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经 替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0009] 本发明还提供编码上述融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示，该基 因中编码水貂细小病毒VP2蛋白的基因序列按照昆虫细胞偏爱密码子优化。
[0010] 本发明还提供含有上述基因的载体、宿主细胞和工程菌。
[0011] 本发明还提供水貂细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1)重组杆 状病毒Bacmid质粒的构建：将如SEQ ID No. 2所示的基因克隆入转移载体pFastBac Dual 中，转化大肠杆菌DHlOBac感受态进行重组，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid ; (2) 水貂细小病毒病毒样颗粒的制备：用重组杆状病毒Bacmid转染昆虫细胞，获得重组杆状病 毒，将重组杆状病毒接种昆虫细胞后即可获得水貂细小病毒病毒样颗粒。
[0012] 本发明中使用的昆虫细胞为草地贪夜蛾卵巢细胞（Sf9细胞）等。
[0013] 本发明还提供由上述方法制备的水貂细小病毒病毒样颗粒。
[0014] 本发明还提供所述水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎抗体中的应 用。
[0015] 本发明还提供了所述水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎诊断用抗 原试剂中的应用。
[0016] 本发明还提供所述水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎疫苗中的应 用。
[0017] 本发明还提供一种水貂病毒性肠炎疫苗，其是将所述的水貂细小病毒病毒样颗粒 不辅以佐剂或任选辅以佐剂制备而成。
[0018] 本发明中使用的佐剂为氢氧化铝，终浓度为5%。
[0019] 本发明提供的水貂病毒性肠炎疫苗为口服疫苗或肌肉注射疫苗。
[0020] 本发明提供的水貂细小病毒病毒样颗粒，其是根据昆虫细胞偏爱密码子，对水貂 细小病毒VP2基因进行优化，将优化后VP2基因的5'端直接与编码部分多角体蛋白的核苷 酸序列相连，然后克隆至转移载体中，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产水貂细小 病毒病毒样颗粒。利用该表达系统可安全、高效、大规模的生产水貂细小病毒病毒样颗粒， 且所得病毒样颗粒滴度高、免疫原性好，肌肉免疫和口服免疫均可诱导水貂机体产生高水 平的特异性抗体，并可抵抗强毒的攻击，对水貂提供很好的保护作用，为制备水貂病毒性肠 炎疫苗奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例2中Pl代重组杆状病毒接种Sf9细胞图片；其中，A为正常 Sf9贴壁细胞对照，B为Pl代重组杆状病毒接种Sf9细胞后细胞病变情况。
[0022] 图2为本发明实施例2中血凝检测结果。
[0023] 图3为本发明实施例2中间接免疫荧光检测结果；其中，A为重组杆状病毒感染的 阳性孔，B为阴性细胞对照孔。
[0024] 图4为本发明实施例2中Western blot结果；其中，泳道1为P3代样品，泳道2 为 Marker。
[0025] 图5为本发明实施例2中电镜负染结果。
[0026] 图6为本发明实施例2中水紹肌肉免疫结果；其中，A为血减抑制抗体滴度，B为 强毒攻击后水貂存活率。
[0027] 图7为本发明实施例2中水貂口服免疫结果；其中，A为血凝抑制抗体滴度，B为 强毒攻击后水貂存活率。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0029] 实施例1水貂细小病毒病毒样颗粒及其制备方法
[0030] 1 材料
[0031] 水貂细小病毒、菌种E. coli DHlOBac、Sf9细胞、胎牛血清由长春西诺生物科技有 限公司提供，pEASY-Blunt Simple载体购自北京全式金生物技术有限公司，pFastBac Dual 载体、脂质体2000购自Invitrogen公司，Phusion DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接 酶购自NEB公司，IPTG、X-gal购自大连宝生物公司，抗生素购自Sigma公司，Grace昆虫细 胞培养基、Sf-900II SFM无血清细胞培养基购自Gibco公司，细胞培养皿、细胞摇瓶购自 Corning公司，DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司。
[0032] 2 方法
[0033] 2. 1病毒基因组的提取
[0034] 将水貂细小病毒同步接种至F81细胞中，37°C CO2培养箱中培养3-5天，细胞培养 物出现明显的细胞病变后，反复冻融3次收毒。对收获的病毒液进行DNA的提取，步骤见 DNA提取试剂盒说明书。
[0035] 2. 2水貂细小病毒VP2序列的测定
[0036] 参考 GenBank 中公布的 MEV 的 VP2 序列（GenBank No. D00765. 1)，根 据序列两端保守区设计扩增引物：VP2-F :5'-ATGAGTGATGGAGCAGT-3' ；VP2-R : 5' -TTAATATAATTTTCTAG-3'。以提取的貂细小病毒DNA为模板，利用扩增引物获得PCR产物 MEV-VP2。将 MEV-VP2 连入 pEASY-Blunt Simple 载体中，得到质粒 MEV-VP2-pEASY。选取电 泳条带大小正确的质粒送公司测序，以得到精确的MEV VP2序列。
[0037] 2. 3 VP2序列优化、分析及引物设计
[0038] 将MEV VP2序列进行优化，优化标准如下：保证编码氨基酸不变前提下，根据昆虫 细胞密码子偏爱性、GC含量、CpG二核苷酸含量、mRNA二级结构优化，去除隐蔽剪切部位、不 成熟的PolyA位点、内部核糖体结合位点、RNA不稳定基序、重复序列（同向重复、反向重复、 二连体重复）、干扰克隆的限制性酶切位点。
[0039] 根据优化的序列MEV-VP2_opti，利用Primer Premier 5软件设计2对引物，分别 可扩增出的VP20RF区域1755bp长度的产物，并在引物的5'端引入酶切位点，上游引物5' 端引入多角体蛋白的12个喊基序列（表1)。
[0040] 表1引物设计信息
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，由部分多角体蛋白序列融合表达于水貂细小病毒VP2 蛋白N端组成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几 个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所 /_J、i 〇
3. 含有权利要求2所述基因的载体。
4. 水貂细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 重组杆状病毒Bacmid的构建：将权利要求2所述的基因克隆入转移载体pFastBac Dual中，转化大肠杆菌DHlOBac感受态进行重组，提取阳性质粒即为重组杆状病毒 Bacmid ； (2) 水貂细小病毒病毒样颗粒的制备：用重组杆状病毒Bacmid转染昆虫细胞，获得重 组杆状病毒，将重组杆状病毒接种昆虫细胞后即可获得水貂细小病毒病毒样颗粒。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2)中使用的昆虫细胞为Sf9细胞。
6. 由权利要求4或5所述的方法制备的水貂细小病毒病毒样颗粒。
7. 权利要求6所述的水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎疫苗中的应用。
8. 权利要求6所述的水貂细小病毒病毒样颗粒在制备水貂病毒性肠炎抗体中的应用。
9. 水貂病毒性肠炎疫苗，其特征在于，将权利要求6所述的水貂细小病毒病毒样颗粒 不辅以佐剂或任选辅以佐剂制备而成。
10. 根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为口服疫苗或肌肉注射疫苗。
【文档编号】C12N7/04GK104403006SQ201410766006
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】金宏丽, 夏晓红, 陈宪平, 付玉, 刘冰, 杨佳, 夏振强, 石晶 申请人:长春西诺生物科技有限公司