利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法

利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法
【专利摘要】本发明公开了属于转基因产品检测领域的用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组。所述的引物组由SEQ ID No：1～SEQ ID No：5所示的一对外围引物、一个交叉引物和一对检测探针引物组成。本发明还公开了含有该引物组的试剂盒，以及利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法，利用本发明的引物组进行恒温扩增反应后，再用核酸试纸条对检测结果进行判读。本发明引物组特异性强，灵敏度高；其次，检测速度快，检测时间短，检测时间缩短到100min，明显提高了检测效率；此外，本发明方法简单实用，不需要复杂仪器设备，尤其适用在基层现场检测。
【专利说明】利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法

【技术领域】：
[0001] 本发明属于转基因产品检测领域。具体涉及用于交叉引物和双探针恒温扩增检测 NOS终止子的引物组，以及含有该引物组的试剂盒，还涉及利用交叉引物和双探针恒温扩增 检测NOS终止子的方法。

【背景技术】：
[0002] 转基因作物（Genetically Modified Organisms, GM0)，是指利用基因工程方法将 其他生物的遗传基因转移到作物中而形成的作物。通常转基因技术，可增加作物的产量、改 善品质、提高抗旱、抗寒或其它特性。但是，对转基因产品的安全性一直是争议的问题。人 们主要有两个忧虑，一是出于健康角度，二是出于生态安全角度。为了保障消费者的知情权 和选择权，国内外纷纷出台相应的法律法规要求对转基因食品进行标识。而转基因植物产 品快速简便的检测方法的建立是标识转基因产品最直接有效的技术支持。
[0003] 根癌农杆菌胭脂碱合成酶（Nopaline Synthase，N0S)基因是一种报告基因，在转 基因研究过程中可快速报告植株是否被成功转化，NOS基因终止子主要存在于马铃薯、大 豆、玉米、甜椒等可能的转基因产品中（刘光明等.食品科学，2005,（5))。已建立的转基 因的检测方法有：常规PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR、LAMP方法等（陈碧华 等.食品科学，2008:705-712)，但是这些体外核酸扩增技术大多需要与电泳、荧光、质谱法 或直接测序等方法结合来进行检测，这些方法大多操作复杂、价格昂贵，而且都是以大型的 仪器设备和熟练的专业技能为前提的检测技术，因此，并不适合于基层单位应用。
[0004] 交叉引物恒温扩增技术（Crossing Priming Isothermal Amplification，CPA) (专利号为：ZL200810134583. I)是杭州优思达生物技术有限公司结合恒温核酸扩增技 术和核酸试纸条快速检测技术而发明的一种操作简单、时间短、成本低的检测技术，可广 泛用于病原体检测等领域。该技术还具有特异性强、灵敏度高的特点，特别适合用于现 场检测。目前该技术结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、肠出血 性大肠杆菌、结核分歧杆菌、恶性疟疾、霍乱弧菌、志贺氏菌、瓜果类斑病菌等病原菌的检 测（祁军等.食品研究开发，2013,34(2):67-70;祁军等.中国媒介生物学及控制杂志， 2013, 24(3) :204-207)。
[0005] 经检索，未发现交叉引物恒温扩增技术在转基因产品检测上应用的报道。


【发明内容】
：
[0006] 针对目前转基因产品检测领域存在的方法复杂、需要专用设备和专业人员、费时 长和成本高等缺点，本发明目的在于提供用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子 的引物组。
[0007] 本发明另一目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试 剂盒。
[0008] 本发明第三目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方 法。
[0009] 实现本发明的技术方案如下：
[0010] 本发明用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组，由一对外围引 物、一个交叉扩增引物和一对检测探针引物组成；
[0011] 其中所述的一对外围引物为：
[0012] 正向外围引物 N0S4s :5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3'（SEQ ID No:l)，
[0013] 反向外围引物 N0S5a :5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'（SEQ ID No:2);
[0014] 所述的交叉引物N0S2als :
[0015] 5' -GTTTATGAGATGGGTTTTTTTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3' （SEQ ID No:3);
[0016] 所述一对检测探针引物为：
[0017] 检测探针 N0S2a* :5,-GTTTATGAGATGGGTTTTT-3，（SEQ ID No:4)
[0018] 检测探针 N0S3a* :5'-TTAGAGTCCCGCAATTATACA-3'（SEQ ID No:5);
[0019] 其中检测探针N0S2a*的5'端标记修饰生物素；检测探针N0S3a*的5'端标记修 饰突光素 FAM。
[0020] 本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试剂盒，包括下列6个 部分，分别为核酸检测试纸条、SSC缓冲液、恒温扩增反应液、Bst DNA聚合酶液、无菌双蒸水 和阳性对照。
[0021] 上述试剂盒中所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条，可从杭州优思达 生物技术有限公司购买。
[0022] 上述试剂盒中所述的SSC缓冲液的组成成分及其比例为：0. 3mol/L NaCl, 0· 03mol/L 柠檬酸钠· 2H20,用 lmol/L HCl 调节 pH 至 7. 0。
[0023] 上述试剂盒中所述的恒温扩增反应液（A管）：其组成成分及其比例为：正向 外围引物N0S4s 0. 24 μ mol/L，反向外围引物N0S5a 0. 24 μ mol/L，交叉引物N0S2als I. 6 μ mol/L，检测探针引物 N0S2a*l. 2 μ mol/L，检测探针引物 N0S3a*0. 8 μ mol/L，dNTPs 溶 液 0.4mmol/L，Betiane 甜菜喊 0.4M，I X Thermol pol buffer。
[0024] 上述试剂盒中所述的I XThermol pol buffer的组成成分及其比例为：IOmM KCl, IOmM(NH4)2S04,20mM Tris-HCl,2mM MgSO4,0. 1% TritonX-100, pH8. 8 ；
[0025] 上述试剂盒中所述的Bst DNA聚合酶液（B管）可购买得到。
[0026] 上述试剂盒中所述的无菌双蒸水（C管），作为阴性对照或补足体系用。
[0027] 上述试剂盒中所述的阳性对照（D管）为含有NOS基因终止子片段的质粒DNA。
[0028] 所述的NOS基因终止子片段由SEQ ID No:6所示的核苷酸序列组成。
[0029] 上述试剂盒中所述的阳性对照的制备方法：以转基因大豆总DNA (或其他带有NOS 终止子的转基因作物或质粒）为模板，以外围引物N0S4s和N0S5a为引物进行PCR扩增，得 大小为180bp (N0S终止子基因片段）的PCR扩增产物，然后按照常规方法将所得PCR扩增 产物克隆、转化；提取质粒DNA，得阳性DNA样品。
[0030] 本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法，包括以下步骤：
[0031] (1)、提取待测样品DNA :利用常规CTAB法（参考基因工程原理和技术，主编邹克 琴、叶子弘）或者其他商业上使用的DNA提取试剂盒提取待测样品的总DNA，备用；
[0032] (2)、利用上述试剂盒配制反应体系（25 μ L):恒温扩增反应液（A管）12. 5 μ L，Bst DNA聚合酶液（B管）1 μ L，双蒸水（C管）10. 5 μ L，待测样品DNA或阳性对照（D管）1 μ L ; 不足部分用双蒸水（C管）补齐；其制备方法为：按照反应体系依次加入双蒸水（C管）、恒 温扩增反应液（Α管）、Bst DNA聚合酶液（Β管）的和待测样品DNA或阳性对照（D管），移 液器吹打混匀（待测样品DNA或阳性对照应在阴性对照和所有样品之后加入）；
[0033] (3)、交叉引物恒温扩增程序：将反应管放置恒温水浴锅内，63 °C温浴60? 90min ；
[0034] (4)、扩增产物的检测：将扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，再将核酸试纸条 放入SSC缓冲液中，5?IOmin后通过试纸条的显色进行判读，若结果为阳性，则样本中含有 检测的核酸，试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性， 则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
[0035] 上述检测方法中所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条，可从杭州优思 达生物技术有限公司购买。
[0036] 所述的引物组在鉴定转基因植物产品上的应用
[0037] 与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和有益效果：（1)特异性强，本发明 只用于检测NOS终止子基因，与其他植物基因无交叉反应；（2)灵敏度高，10个拷贝/ μ L就 可以检测到；（3)检测速度快，与传统的检测方法相比，本发明将检测时间缩短到lOOmin， 明显提高了检测效率；(4)本发明方法简单实用，不需要复杂仪器设备，只用恒温水浴锅即 可完成扩增，扩增产物通过一次性试纸条进行检测，5?IOmin即可完成检测结果的判读， 尤其适用在基层现场检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0038] 图1.按行业标准SNT1195-2003 :大豆转基因成分的定性PCR检测电泳图谱；其中 M为IOObp DNA Ladder，1为转基因大豆，2为空白对照。
[0039] 图2.不同组引物CPA反应体系恒温扩增检测电泳图谱；其中1和2为C组引物， 3和4为B组引物，5为A组引物。
[0040] 图3.CPA反应体系恒温扩增后核酸试纸条检测照片；其中1为空白对照，2为转基 因大豆。
[0041] 图4.质粒DNA M13引物PCR检测电泳图谱；其中1为空白质粒；2和3为非目标 质粒；4为目标质粒。
[0042] 图5.不同探针浓度的CPA扩增后核酸试纸条检测照片；其中1为空白对照，2为 NOS 2a*N0S 3a* 分别为 0· 8 和 0· 4 μ mol/L，3 为 NOS 2a*N0S 3a* 分别为 0· 6 和 0· 4 μ mol/ L，4 为 NOS 2a*N0S 3a* 分别为 0· 4 和 0· 4μ mol/L。
[0043] 图6.不同模板浓度的CPA扩增后试纸条检测照片；其中I模板浓度为IOcopies/ μ L，2.模板浓度为IO2Copies/ μ L，3.模板浓度为IO3Copies/ μ L，4.模板浓度为 IO4Copies/ μ L0
[0044] 图7.特异性核酸试纸条检测照片；其中1为转基因大豆，2为田间杂草1，3为田 间杂草2,4为农民售卖大豆。

【具体实施方式】：
[0045] 下面具体实施例仅用于对本发明作进一步的说明，但是对本发明的保护范围不构 成任何限制。下面实施例中所用的方法，如无特别说明，均为本领域技术人员熟知的方法， 所用药品和试剂也为本领域人员熟知的。下述实施例中引物与探针由上海生工生物工程技 术有限公司合成、Thermo pol Buffer (热聚合缓冲液）和Bst DNA pol多聚酶购自北京纽 英伦生物技术有限公司、dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司、Betiane (甜菜碱）购自 阿拉丁试剂有限公司，所用核酸试纸条是购自杭州优思达生物技术有限公司3号核酸试纸 条等。
[0046] 实施例1本发明交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物筛选
[0047] 选用海关进口检测为转基因阳性的大豆样品，用CTAB法提取基因组DNA为模板。 以中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT1195-2003 :大豆转基因成分的定性PCR检 测方中NOS基因检测的一对正反向引物（即外围引物NOS 4s/5a)进行PCR(图1)。PCR产 物送上海生物工程技术有限公司测序验证正确后，参考oligo 7、Primer primer 5、LAMP软 件（http://primerexplorer. jp/e/)和CPA反应体系在NOS 180bp区段设计并评价3组引 物，序列如下：
[0048] A组引物：
[0049] N0S3al :5, -TGTATAATTGCGGGACTCTAA-3'
[0050] N0S2al :5' -TTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3'
[0051] N0S2alsl ：
[0052] 5' -GTTTGTTTTCTATCGTGTATTAGTTTATGAGATGGGTTTTT-3' ；
[0053] B组引物：
[0054] N0S3a2 :5, -AAAACCCATCTCATAAAACA-3'
[0055] N0S2a2 :5' -GTATAATTGCGGGACTCTA-3'
[0056] N0S2als2 ：
[0057] 5' -GTATAATTGCGGGACTCTACGTTAAGCATGTAATAAT-3' ；
[0058] C组引物：
[0059] N0S3a :5, -TTAGAGTCCCGCAATTATACA-3,（SEQ ID No:4)
[0060] N0S2a :5, -GTTTATGAGATGGGTTTTT-3,（SEQ ID No:5)
[0061] N0S2als ：
[0062] 5' -GTTTATGAGATGGGTTTTTTTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3' （SEQ ID No:3)
[0063] 注：此处C组引物N0S2a和N0S3a尚未加标记，其序列分别与SEQ ID No:4与SEQ ID No:5 -致。
[0064] 按照表1反应体系（25 μ L)进行恒温扩增，CPA反应程序：63°C恒温扩增90min ; 扩增结果用琼脂糖电泳检测。
[0065] 表1恒温扩增反应体系（以下为终浓度）
[0066]

【权利要求】
1. 用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组，其特征在于由一对外围 引物、一个交叉引物和一对检测探针引物组成； 其中所述的一对外围引物为： 反向外围引物 N0S5a:5' -GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'（SEQ ID No:2); 所述的交叉引物N0S2als : 5, -GTTTATGAGATGGGTTTTTTTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3, (SEQ ID No :3)； 所述一对检测探针引物为： 检测探针 N0S2a*:5' -GITTATGAGATGGGmTT-3'（SEQ ID No:4) 检测探针 N0S3a*:5' -TTAGAGTCCCGCAATTATACA-3'（SEQ ID No:5); 其中检测探针N0S2a*的5'端标记修饰生物素；检测探针N0S3a*的5'端标记修饰突 光素FAM。
2. 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测N0S终止子的试剂盒，其特征在于包括下列6 个部分，分别为核酸检测试纸条、SSC缓冲液、恒温扩增反应液（A管）、Bst DNA聚合酶液（B 管）、无菌双蒸水（C管）和阳性对照；其中恒温扩增反应液（A管）的组成成分及其比例为： 正向外围引物N0S4s0. 24iimol/L，反向外围引物N0S5a 0. 24iimol/L，交叉引物N0S2als 1. 6 ii mol/L，检测探针引物 N0S2a*l. 2 ii mol/L，检测探针引物 N0S3a*0. 8 ii mol/L，dNTPs 溶 液0.41111]1〇1/1，1361：1&116甜菜喊0.4]\1，1\11161'1]1〇1卩〇11311打61'。
3. 按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检 测试纸条。
4. 按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的SSC缓冲液的组成成分及其比例 为：0? 3mol/L NaCl, 0? 03mol/L 柠檬酸钠? 2H20,用 lmol/L HC1 调节 pH 至 7. 0。
5. 按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的lXThermol pol buffer的组成 成分及其比例为：10mM KCl，10mM(NH4)2S04,20mM Tris-HCl，2mM MgS04,0. l%TritonX-100， pH8. 8〇
6. 按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照（D管）为含有NOS基因 终止子片段的质粒DNA。
7. 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测N0S终止子的方法，其特征在于包括以下步 骤： (1)提取待测样品DNA ; ⑵利用权利要求2所述的试剂盒配制反应体系（25 yL):恒温扩增反应液（A 管）12. 5 y L，Bst DNA聚合酶液（B管）1 y L，双蒸水（C管）10. 5 y L，待测样品DNA或阳性 对照（D管）1 y L ;不足部分用双蒸水（C管）补齐；其制备方法为：按照反应体系向反应管 中依次加入双蒸水（C管）、恒温扩增反应液（A管）、Bst DNA聚合酶液（B管）的和待测样 品DNA或阳性对照（D管），移液器吹打混匀； (3) 将反应管放置恒温水浴锅内，63°C温浴60?90min ; (4) 将扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，再将核酸试纸条放入SSC缓冲液中，5? lOmin后通过试纸条的显色进行判读，若结果为阳性，则样本中含有检测的核酸，试纸条出 现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性，则只有质控区出现一 条红色条带，检测区没有条带。
8. 按照权利要求7所述的方法，其特征在于所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测 试纸条。
9. 权利要求1所述的引物组在鉴定转基因植物产品上的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104388578SQ201410775330
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】潘家荣, 张晗, 冯涛, 张雪妍, 王冉, 罗小涵, 梁未, 李素芳 申请人:中国计量学院