基于甲基化水平检测脆性x染色体综合征的定量比较法及其引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了脆性X染色体综合征FMR1基因上游CpG岛异常甲基化的检测法所用引物的设置法：扩增引物设计的位置不覆盖任何CG二核苷酸，以保证经亚硫酸氢盐处理的PCR扩增无偏性。具体如下：为FMR1基因上游CpG岛区域设计的1对扩增引物：Pyro_A_F：TGAGTGTATTTTTGTAGAAATGGG，Pyro_A_R：TCTCTCTTCAAATAACCTAAAAAC。本发明还同时提供了稳定快速地通过定量比较CpG岛甲基化水平从而检测脆性X染色体综合征的方法，采用本发明能解决目前为止定量检测FMR1启动子异常甲基化的方法仍不成熟、尤其无法实现对单个CpG位点的定量检测的缺陷。
【专利说明】基于甲基化水平检测脆性X染色体综合征的定量比较法及 其引物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及先天性遗传缺陷脆性X染色体综合症（Fragile X syndrome, FXS)检 测，属于分子生物学及遗传病临床诊断领域，对脆性X染色体综合征FMRl基因的5'端上游 CpG岛异常甲基化水平的定量检测。
【背景技术】
[0002] 脆性X染色体是指X染色体的Xq27_q28区出现细丝状次缢痕，末端呈随体结构， 因而该部位易发生断裂，故称脆性位点。这种非正常状态的X染色体导致的疾病称脆性X 染色体综合征，是仅次于先天愚型的第二大遗传性智力低下综合征，遗传方式为X连锁遗 传。主要临床表现为语言发育迟缓，智力障碍（IQ30-50)，面部异常：长脸，大耳，下颁大而 前突，并伴随攻击性行为和孤独症。该病多见于男性（群体发病率约〇. 025% )，由于女性 有两条X染色体，所以通常表现为轻度智力低下，发病率约为男性一半。
[0003] 脆性X染色体综合征致病基因 FMRl (Fragile X Mental Retardation)位于 Xq27.3,该基因5'非编码区（CGG)n三核苷酸重复序列在正常人群中重复数目6?54次。 当重复数目增加至55?200次时，称前突变，前突变不会引起相邻CpG岛甲基化，通常无或 只伴随轻微症状。当重复数目达到200次以上，称为全突变，将导致相邻CpG岛异常甲基化， 进而导致FMRl基因的表达下调甚至沉默引起疾病。通常，女性前突变携带者的CGG重复序 列在遗传给后代的过程中极易发生突增，造成后代全突变。
[0004] 脆性X染色体综合征患者FMRl基因的启动子区CpG岛发生异常甲基化，在转录水 平被沉默，因此导致基因表达产物FMRP(Fragile X Mental Retardation Protein)的缺 失。FMRl基因含有17个外显子，通过可变剪接机制可产生12种不同蛋白亚型。在不同组 织器官具有不同水平的表达。FMRP是一种重要的RNA结合蛋白，可以结合若干编码，非编 码RNA或microRNA。FMRP是一种重要的RNA结合蛋白，与RNA的转运、稳定性以及翻译有 重要联系。在神经元中，FMPR的缺失将导致突触可塑性过度增加，影响长期记忆等，导致脆 性X染色体综合征。
[0005] 脆性X染色体综合征的诊断技术自上世纪八十年代逐步发展，Rousseau等1991年 报道了 Southern Blot技术，可检出CGG重复序列的异常扩展，也可评估甲基化异常状态。 但是该方法实验操作繁锁、实验周期长、对DNA纯度要求苛刻、只能平行检测少量样本，且 成本费用很高，因此难以进行大规模筛查诊断，临床应用十分有限。聚合酶链式反应（PCR) 技术操作简便，可以检出CGG重复数目较少的前突变，但随着重复数目增多，该方法的灵敏 度逐渐下降，信号易缺失，无法判断结果，故难以准确检出大于200次的CGG全突变，虽然近 年来传统方法得到一定程度的改善，如嵌合引物（chimera primer)和毛细管电泳技术的使 用，但对CGG高重复数的检测仍尚未达到稳定可靠的程度。因此，美国疾病控制与预防中心 指出，甲基化异常的检测对脆性X染色体综合征的诊断十分必要，其指示作用甚至高于通 过CGG重复数目做出的判断。
[0006] 甲基化检测技术近年来发展迅速，如甲基化特异性PCR(MS-PCR)，甲基化荧光定量 PCR(MethyLight)，甲基化特异性高分辨率溶解曲线（MS-HRM)，亚硫酸氢盐修饰焦磷酸测序 (BS-Pyrosequencing)等技术被广泛应用于癌症及遗传病分子诊断中。焦磷酸测序技术可 实现同时准确测序及精确定量，通过边合成边测序的原理一次加入一种碱基，保证测序结 果的准确性；通过递进式生物发光反应（发光计量线性相关系数R 2X). 99)实现精确定量。 焦磷酸测序重复性好、结果稳定、速度快（通常一个完整的反应仅需30分钟至1小时）、应 用灵活、易于操作、输出量高，可同时检测96个样品。在甲基化检测的应用方面焦磷酸测序 技术也有独特的优势，相较于普通MS-PCR具有更好的灵活性，不但可应用于CpG富集区， 而且可应用于CpG寡聚区，拓宽了其可应用区域；焦磷酸测序通过连续多对测序引物可以 实现广覆盖的甲基化定量检测且降低检测成本，这是大多数其他甲基化检测技术无法实现 的。脆性X染色体综合征具有独特的遗传方式，前突变只通过女性向后代扩展为全突变。焦 磷酸测序具备对单一等位片段检测的能力，这可能提供非常有价值的遗传信息。
[0007] 目前为止，焦磷酸测序技术尚未实现应用于脆性X染色体综合征的甲基化检测。 虽然近年来一些其他甲基化检测技术开始应用于该病的异常甲基化检测，但都有较明显的 局限性，故该技术仍有很大发展空间。甲基化特异性PCR应用较为广泛，但该方法只能通过 电泳条带的明暗来定性判断甲基化水平，对于甲基化嵌合体等甲基化水平较低的现象难以 明确区分。甲基化荧光定量PCR实现了定量检测，但是基于Taqman探针的方法使可检测 的区域仅局限于3?4个CpG位点，无法检测其他位置；且探针的设计固定了各个位点，即 将各位点看做整体，若异常仅发生在某一个CpG点将无法检出。甲基化特异性高分辨率溶 解曲线技术在脆性X染色体综合症甲基化检测的应用仍不够成熟，尚无报道在启动子CpG 岛实现很精确的甲基化定量分析，且此法也只能考察整体甲基化水平，无法检测某一个CpG 点的甲基化异常。甲基化敏感限制性内切酶-定量PCR是基于甲基化敏感限制酶的方法， 虽然可实现相对定量，但是可检测范围局限于酶切位点，即1?2个CpG位点，由于酶切前 处理以及高GC含量的影响，该方法对操作条件要求较高，稳定性不理想。焦磷酸测序可以 检测单个CpG岛的甲基化水平，且可通过单一模板多对引物测序同时获取大量单个CpG岛 甲基化信息。
[0008] 为了提高脆性X染色体综合征甲基化检测的能力，拟发展一种稳定快速的以焦磷 酸测序技术为主，通过定量比较CpG甲基化水平检测脆性X染色体综合征。预期该技术方 法更快速简便准确，可提高脆性X染色体综合征的检出率，以便尽早采取有效的干预手段 以及辅助生殖技术，预防出生缺陷，提高出生人口质量。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种稳定快速地通过定量比较CpG岛甲基化水 平从而检测脆性X染色体综合征的方法及所用引物；本发明的方法能解决目前为止定量检 测FMRl启动子异常甲基化的方法仍不成熟，尤其无法实现对单个CpG位点的定量检测的缺 陷。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种脆性X染色体综合征FMRl基因上游CpG 岛异常甲基化的检测法所用引物的设置法：扩增引物设计的位置不覆盖任何CG二核苷酸， 以保证经亚硫酸氢盐处理的PCR扩增无偏性（即，FMRl基因上游CpG岛区域设计扩增引物 位置避开CG二核苷酸，以保证在亚硫酸氢盐处理后的PCR扩增无偏性。）
[0011] 本发明还同时提供了一种脆性X染色体综合征FMRl基因上游CpG岛异常甲基化 的检测法所用引物：
[0012] 为FMRl基因上游CpG岛区域设计的1对扩增引物（Pyro_A):
[0013] Pyro_A_F ： TGAGTGTATTTTTGTAGAAATGGG,
[0014] Pyro_A_R ： TCTCTCTTCAAATAACCTAAAAAC 〇
[0015] 作为本发明的脆性X染色体综合征FMRl基因上游CpG岛异常甲基化的检测方法 所用的引物的改进：
[0016] 还包括1条测序引物（扩增片段中的CG二核苷酸富集区域前设计1条测序引 物）：
[0017] Pyro_S ：TTTTTYGTTTTTTATTAAGT〇
[0018] 作为本发明的脆性X染色体综合征FMRl基因上游CpG岛异常甲基化的检测方法 所用的引物的进一步改进：
[0019] Pyro_A_R的5 '端用生物素标记。
[0020] 在发明过程中，发明人发现：焦磷酸测序技术可解决诸多脆性X染色体综合征甲 基化检测技术的局限性，提供丰富的信息；1)实现甲基化的定量检测并建立阈值，提高检 出率；2)实现单CpG位点检测，提高检测特异性；3)检测位点灵活，可多可少，提高检测覆 盖度；4)检测速度快，稳定性好，输出量高。
[0021] 本发明技术方案具体如下：
[0022] FMRl基因5'UTR的CGG重复序列上游启动子约300bp存在富含CG的CpG岛区域。 脆性X染色体综合征患者在该区域异常甲基化，导致FMRl基因表达的异常下调或沉默。本 发明的方案基于亚硫酸氢盐修饰技术（亚硫酸氢盐修饰是目前应用较广泛的一种甲基化 水平检测手段）和焦磷酸测序技术对特定CpG位点进行甲基化定量检测。通常，DNA的甲 基化发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，这样的二核苷酸成簇排列在基因组小范围DNA区域， 使得GC含量大于55%，称为CpG岛。该结构往往出现在基因的转录调控区域，其甲基化可 引起基因的表达失活。正常的CpG岛甲基化是重要的基因表达调控手段之一，而异常甲基 化和遗传病、癌症发生相关。将目标DNA在低pH、高温、高浓度亚硫酸氢盐环境下孵育可使 CpG岛未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶。而甲基化的胞嘧啶将维持原来的胞嘧啶。于是，亚 硫酸氢盐处理后产生了两种（甲基化、未甲基化）不同的序列。利用焦磷酸测序技术对这两 种片段进行定量测序分析即可得到若干单CpG位点的甲基化水平信息。焦磷酸测序不同于 Sanger测序，它利用边合成边测序的原理进行测序。每次加入一种核苷酸A/T/C/G，单核苷 酸合成时释放的焦磷酸经过一系列反应最终会以光信号的形式被捕捉进而实现定量测序， 光信号的强度可用于定量分析。在FMRl基因上游CpG岛区域设计1对扩增引物（Pyro_A)， 引物设计的位置不覆盖任何CG二核苷酸，以保证经亚硫酸氢盐处理的PCR扩增无偏性。这 对引物中的下游引物5'端用生物素标记。在扩增片段中的CG二核苷酸富集区域前设计1 条测序引物（Pyro_S(SEQIDNO:3))，引物序列见表1 :
[0023] 表1焦磷酸测序引物序列
[0024]
【权利要求】
1. 脆性X染色体综合征FMR1基因上游CpG岛异常甲基化的检测法所用引物的设置法， 其特征是：扩增引物设计的位置不覆盖任何CG二核苷酸，以保证经亚硫酸氢盐处理的PCR 扩增无偏性。
2. 脆性X染色体综合征FMR1基因上游CpG岛异常甲基化的检测法所用引物，其特征 是： 为FMR1基因上游CpG岛区域设计的1对扩增引物： Pyro_A_F ： TGAGTGTATTTTTGTAGAAATGGG, Pyro_A_R ： TCTCTCTTCAAATAACCTAAAAAC 〇
3. 根据权要求2所述的脆性X染色体综合征FMR1基因上游CpG岛异常甲基化的检测 方法所用的引物，其特征是： 还包括1条测序引物： Pyro_S ：TTTTTYGTTTTTTATTAAGT〇
4. 根据权要求2或3所述的脆性X染色体综合征FMR1基因上游CpG岛异常甲基化的 检测方法所用的引物，其特征是： Pyro_A_R的5'端用生物素标记。
【文档编号】C12N15/11GK104498607SQ201410784929
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】祁鸣, 翁琛 申请人:绍兴华因生物科技有限公司