一种海洋微藻叶黄素的提取工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种海洋微藻叶黄素的提取工艺，通过基因工程技术对高产叶黄素海洋微藻进行分子生物学改造得到优质叶黄素生产藻种，采用柱层析色谱分离纯化微藻中的叶黄素，并利用重结晶技术对叶黄素产品进行精制。本发明的有益效果是劳动成本低，不受时间、空间的限制，产量高，质量好，安全环保，产生良好的经济与社会效益。
【专利说明】一种海洋微藻叶黄素的提取工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于叶黄素提取领域，尤其是涉及一种海洋微藻叶黄素的提取工艺。
【背景技术】
[0002]在现有的技术中，海洋微藻叶黄素的提取工艺通常是采用光自养培养模式或者异养培养模式，较低的胞内叶黄素含量和叶黄素产率，同时加上微藻大规模培养较高的成本，制约了应用微藻培养来生产叶黄素的产业化进程。
【发明内容】
[0003]为了克服上述现有技术的不足，本发明公开一种海洋微藻叶黄素的提取工艺，劳动成本低，不受时间、空间的限制，产量高，质量好，安全环保，产生良好的经济与社会效益。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种海洋微藻叶黄素的提取工艺，其特征在于:包括以下步骤:
[0005](I)采用叶绿素荧光成像系统，快速高通量筛选叶绿素荧光强的微藻，将初步筛选的待定微藻进行扩大培养，利用高效液相色谱(HPLC)准确分析藻细胞中叶黄素含量，最终筛选到叶黄素含量高的优质微藻。
[0006](2)对筛选的优质高产叶黄素微藻进行基因组测序，并利用生物信息学软件进行基因功能注释与进化分析。
[0007](3)培养海洋微藻至对数生长期中期，利用RNA-seq测序技术进行基因转录水平分析，并根据各个基因表达水平的高低，初步筛选叶黄素合成途径中的限制性关键酶，初步构建该藻细胞内叶黄素的合成途径。
[0008](4)构建尚广叶黄素基因工程操株，提尚叶黄素合成途径关键酶的活力，从而提尚叶黄素的合成量。
[0009](5)提取海洋微藻细胞总RNA，利用逆转录PCR扩增DXSl，GGPPS, PSY, LCYE等酶的cRNA，将PCR产物连接到载体pMD18-T，进行测序验证。
[0010](6)构建表达载体并进行表达载体转化，得到高产叶黄素基因工程藻。
[0011](7)将基因工程藻进行发酵培养，使得小球藻叶黄素的合成量达到8-10mg/Ml，在水平管式光合反应器中进行扩大培养，确定培养液流动的速度，光照强度，CO2通入量等参数。
[0012](8)采用复合酶进行酶法破壁，再利用低渗缓冲溶液，使细胞内容物膨胀，然后用超声波进行辅助破碎，提高破壁效果。
[0013](9)使用乙醇作为携带剂，利用均匀设计优化萃取条件，利用HPLC以及HPLC-MS检测与鉴定提取物中叶黄素的含量，并计算提取率。
[0014](10)采用柱层析色谱对叶黄素进行分离纯化，用丙酮提取破壁后的小球藻细胞中的总色素，然后采用聚苯乙烯-二乙烯苯型反相树脂进行反相层析分离叶黄素与叶绿素及其它类胡萝卜素，确定正己烷-甲醇-水洗脱体系的溶剂配比，并进行梯度洗脱，收集叶黄素组分，最后利用重结晶技术进行精制，得到叶黄素纯品，检测含量并计算提取率。
[0015]步骤(6)中构建表达载体的方法优选为:
[0016]设计引物，添加限制性酶切位点KpnI和ApaI，利用PCR扩增表达载体pHYG3自带的启动子beta2-tubulin promoter，酶切后将该启动子插入到表达载体pHYG3多克隆位点区域；
[0017]设计特异性引物，添加限制性酶切位点ApaI与NdeI，将逆转录PCR扩增到的DXSI, GGPPS, PSY, LCYE 等酶的基因并插入到位于 beta2_tubulin promoter 之后的 pHYG3载体的多克隆位点处，构建高表达载体。
[0018]步骤(6)中表达载体转化的方法优选为:
[0019]将构建好的表达载体通过电转化方法转化到宿主藻细胞，筛选抗潮霉素B (hygromycin B)阳性转化子，培养72h，利用RT-PCR检测培养过程中GGPPS, PSY等基因表达量的变化，同时利用Western blot检测相关酶的含量变化；
[0020]将阳性转化子进行液体发酵培养，检测阳性转化子中叶黄素含量，得到高产叶黄素基因工程藻。
[0021]步骤(8)中复合酶进行酶法破壁的方法优选为:
[0022]选用纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶等进行复配，对微藻细胞壁进行酶解，通过显微镜观察破壁效果。
[0023]本发明具有的优点和积极效果是:通过基因工程技术对高产叶黄素海洋微藻进行分子生物学改造得到优质叶黄素生产藻种，采用柱层析色谱分离纯化微藻中的叶黄素，并利用重结晶技术对叶黄素产品进行精制，劳动成本低，不受时间、空间的限制，产量高，质量好，安全环保，为叶黄素类药品及保健品的生产提供绿色，安全，高质量的叶黄素原料，产生良好的经济与社会效益。
【具体实施方式】
[0024]本发明公开一种海洋微藻叶黄素的提取工艺，包括以下步骤:
[0025](I)采用叶绿素荧光成像系统，快速高通量筛选叶绿素荧光强的微藻，将初步筛选的待定微藻进行扩大培养，利用高效液相色谱(HPLC)准确分析藻细胞中叶黄素含量，最终筛选到叶黄素含量高的优质微藻。
[0026](2)对筛选的优质高产叶黄素微藻进行基因组测序，并利用生物信息学软件进行基因功能注释与进化分析。
[0027](3)培养海洋微藻至对数生长期中期，利用RNA-seq测序技术进行基因转录水平分析，并根据各个基因表达水平的高低，初步筛选叶黄素合成途径中的限制性关键酶，初步构建该藻细胞内叶黄素的合成途径。
[0028](4)构建尚广叶黄素基因工程操株，提尚叶黄素合成途径关键酶的活力，从而提尚叶黄素的合成量。
[0029](5)提取海洋微藻细胞总RNA，利用逆转录PCR扩增DXSl，GGPPS, PSY, LCYE等酶的cRNA，将PCR产物连接到载体pMD18-T，进行测序验证。
[0030](6)构建表达载体并进行表达载体转化，得到高产叶黄素基因工程藻。
[0031](7)将基因工程藻进行发酵培养，使得小球藻叶黄素的合成量达到8-10mg/Ml，在水平管式光合反应器中进行扩大培养，确定培养液流动的速度，光照强度，CO2通入量等参数。
[0032](8)采用复合酶进行酶法破壁，再利用低渗缓冲溶液，使细胞内容物膨胀，然后用超声波进行辅助破碎，提高破壁效果。
[0033](9)使用乙醇作为携带剂，利用均匀设计优化萃取条件，利用HPLC以及HPLC-MS检测与鉴定提取物中叶黄素的含量，并计算提取率。
[0034](10)采用柱层析色谱对叶黄素进行分离纯化，用丙酮提取破壁后的小球藻细胞中的总色素，然后采用聚苯乙烯-二乙烯苯型反相树脂进行反相层析分离叶黄素与叶绿素及其它类胡萝卜素，确定正己烷-甲醇-水洗脱体系的溶剂配比，并进行梯度洗脱，收集叶黄素组分，最后利用重结晶技术进行精制，得到叶黄素纯品，检测含量并计算提取率。
[0035]步骤(6)中构建表达载体的方法优选为:
[0036]设计引物，添加限制性酶切位点KpnI和ApaI，利用PCR扩增表达载体pHYG3自带的启动子beta2-tubulin promoter，酶切后将该启动子插入到表达载体pHYG3多克隆位点区域；
[0037]设计特异性引物，添加限制性酶切位点ApaI与NdeI，将逆转录PCR扩增到的DXSI, GGPPS, PSY, LCYE 等酶的基因并插入到位于 beta2_tubulin promoter 之后的 pHYG3载体的多克隆位点处，构建高表达载体。
[0038]步骤(6)中表达载体转化的方法优选为:
[0039]将构建好的表达载体通过电转化方法转化到宿主藻细胞，筛选抗潮霉素B (hygromycin B)阳性转化子，培养72h，利用RT-PCR检测培养过程中GGPPS, PSY等基因表达量的变化，同时利用Western blot检测相关酶的含量变化；
[0040]将阳性转化子进行液体发酵培养，检测阳性转化子中叶黄素含量，得到高产叶黄素基因工程藻。
[0041]步骤(8)中复合酶进行酶法破壁的方法优选为:
[0042]选用纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶等进行复配，对微藻细胞壁进行酶解，通过显微镜观察破壁效果。
[0043]以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【权利要求】
1.一种海洋微藻叶黄素的提取工艺，其特征在于:包括以下步骤: (1)采用叶绿素荧光成像系统，快速高通量筛选叶绿素荧光强的微藻，将初步筛选的待定微藻进行扩大培养，利用高效液相色谱(HPLC)准确分析藻细胞中叶黄素含量，最终筛选到叶黄素含量高的优质微藻。 (2)对筛选的优质高产叶黄素微藻进行基因组测序，并利用生物信息学软件进行基因功能注释与进化分析。 (3)培养海洋微藻至对数生长期中期，利用RNA-seq测序技术进行基因转录水平分析，并根据各个基因表达水平的高低，初步筛选叶黄素合成途径中的限制性关键酶，初步构建该藻细胞内叶黄素的合成途径。 (4)构建尚广叶黄素基因工程澡株，提尚叶黄素合成途径关键酶的活力，从而提尚叶黄素的合成量。 (5)提取海洋微藻细胞总RNA，利用逆转录PCR扩增DXSI，GGPPS,PSY, LCYE等酶的cRNA，将PCR产物连接到载体pMD18-T，进行测序验证。 (6)构建表达载体并进行表达载体转化，得到高产叶黄素基因工程藻。 (7)将基因工程藻进行发酵培养，使得小球藻叶黄素的合成量达到8-10mg/Ml，在水平管式光合反应器中进行扩大培养，确定培养液流动的速度，光照强度，0)2通入量等参数。 (8)采用复合酶进行酶法破壁，再利用低渗缓冲溶液，使细胞内容物膨胀，然后用超声波进行辅助破碎，提高破壁效果。 (9)使用乙醇作为携带剂，利用均匀设计优化萃取条件，利用HPLC以及HPLC-MS检测与鉴定提取物中叶黄素的含量，并计算提取率。 (10)采用柱层析色谱对叶黄素进行分离纯化，用丙酮提取破壁后的小球藻细胞中的总色素，然后采用聚苯乙烯-二乙烯苯型反相树脂进行反相层析分离叶黄素与叶绿素及其它类胡萝卜素，确定正己烷-甲醇-水洗脱体系的溶剂配比，并进行梯度洗脱，收集叶黄素组分，最后利用重结晶技术进行精制，得到叶黄素纯品，检测含量并计算提取率。
2.根据权利要求1所述的海洋微藻叶黄素的提取工艺，其特征在于:步骤(6)中构建表达载体的方法优选为: 设计引物，添加限制性酶切位点KpnI和Apal，利用PCR扩增表达载体pHYG3自带的启动子beta2-tubulin promoter，酶切后将该启动子插入到表达载体pHYG3多克隆位点区域； 设计特异性引物，添加限制性酶切位点ApaI与Nde I，将逆转录PCR扩增到的DXSI，GGPPS，PSY，LCYE等酶的基因并插入到位于beta2_tubulin promoter之后的pHYG3载体的多克隆位点处，构建高表达载体。
3.根据权利要求1所述的海洋微藻叶黄素的提取工艺，其特征在于:步骤￠)中表达载体转化的方法优选为: 将构建好的表达载体通过电转化方法转化到宿主藻细胞，筛选抗潮霉素B (hygromycinB)阳性转化子，培养72h，利用RT-PCR检测培养过程中GGPPS，PSY等基因表达量的变化，同时利用Western blot检测相关酶的含量变化； 将阳性转化子进行液体发酵培养，检测阳性转化子中叶黄素含量，得到高产叶黄素基因工程藻。
4.根据权利要求1所述的海洋微藻叶黄素的提取工艺，其特征在于:步骤(8)中复合酶进行酶法破壁的方法优选为: 选用纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶等进行复配，对微藻细胞壁进行酶解，通过显微镜观察破壁效果。
【文档编号】C12R1/89GK104450850SQ201410790236
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】季延滨, 李涛 申请人:芝圣（天津）生物科技有限公司