一种鉴定参与毛发发育细胞的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定参与毛发发育细胞的方法及应用，属于毛发发育【技术领域】。本发明所提供的方法是先分别分离培养待测细胞和毛乳头细胞，再分别将毛乳头细胞和待测细胞接种到插入式培养皿的上下表面进行共培养，同时单独培养毛乳头细胞，培养结束后测定单独培养的毛乳头细胞团平均直径和共培养细胞团平均直径，再根据判定公式判定待测细胞是否参与毛发发育。本发明所提供的方法首次实现了通过待测细胞与毛乳头细胞共培养的方式，来鉴定待测细胞是否参与毛发发育，培养条件更加接近生物体内环境，克服了现有技术中仅仅通过单一或几个基因或化学试剂来研究所带来的比较片面的问题。
【专利说明】一种鉴定参与毛发发育细胞的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定参与毛发发育细胞的方法及应用，属于毛发发育【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 毛发发育不良和发育过剩一直是困扰人们的一大生命科学难题。毛发的发育起源 于毛囊的毛乳头细胞，一个毛乳头细胞团形成一根毛发。毛乳头细胞团的密度，决定了毛发 形成的密度；毛乳头细胞团大，形成的毛发的毛干粗大；毛乳头细胞团小，形成的毛发毛干 细小。因此，可以通过评价毛乳头细胞团的密度、大小和数量来预测毛发的发育状况。毛乳 头细胞团的形成和发育状况与其所处的微环境有密切关系。处于毛囊周围影响毛囊微环境 的细胞均可能直接或间接参与调控毛乳头细胞团的形成和发育。现今，研究人员已充分认 识到毛囊中毛乳头细胞团的大小与毛发发育的关系，目前主流研究方案均集中在通过基因 沉默、基因过表达或化学试剂作用于毛囊和（或）毛乳头细胞来影响毛发发育。该方案只 能对单一因子的基因或者化学试剂来说，的确是很合适，但毛发的发育并不仅仅是某个或 某几个基因作用的结果，而是错综复杂的生命体内复杂生化活动的综合结果。仅通过单个 基因或者化学试剂来判定细胞与毛发发育的关系存在结果片面，不能够真实反映细胞对毛 发发育影响的问题。因此，模拟体内微环境是探索影响毛发发育的某类因素的有效方式。目 前为止尚没有通过共培养抑制或刺激毛乳头细胞团来影响毛发发育的报道。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种鉴定参与毛发发育细胞的方法，所采取的技 术方案如下：
[0004] 本发明的目的在于提供一种鉴定参与毛发发育细胞的方法，该方法是先分别分离 培养待测细胞和毛乳头细胞，再分别将毛乳头细胞和待测细胞接种到插入式培养皿的上下 表面进行共培养，同时单独培养毛乳头细胞，培养结束后测定单独培养的毛乳头细胞团平 均直径和共培养细胞团平均直径，再根据判定公式判定待测细胞是否参与毛发发育。
[0005] 所述判定公式，是：
[0006] x = (b~a) / a
[0007] 其中，a，单独培养的毛乳头细胞团平均直径；b，共培养细胞团平均直径。
[0008] 所述按照判定公式进行判定，是按照以下情况进行判定：
[0009] 1)当|x|〈0. 1，待测细胞不参与毛发发育；
[0010] 2)当|x|彡0. 1，待测细胞参与毛发发育，其中，x彡0. 1，待测细胞对毛发发育 具有促进作用；x< _〇. 1，待测细胞对毛发发育具有抑制作用。
[0011] 所述方法的步骤如下：
[0012] 1)分离培养待测细胞，获得待测细胞；
[0013] 2)分离培养毛乳头细胞，获得毛乳头细胞；
[0014] 3)将步骤1)所得的待测细胞接种到插入式培养皿的下表面，将步骤2)所得的毛 乳头细胞接种到插入式培养皿的上表面，进行共培养；同时在相同条件下，单独培养毛乳头 细胞，培养结束后，获得共培养细胞团和单独培养毛乳头细胞团；
[0015] 4)利用显微镜的长度标尺测定单独培养毛乳头细胞团平均直径a和共培养细胞 团平均直径b，根据判定公式x = (b_a)/a，判定待测细胞是否参与毛发发育。
[0016] 步骤3)所述共培养，将毛乳头细胞和待测细胞按10:1的接种量分别接种到插入 皿的上下表面，24孔培养皿毛乳头细胞接种量为1 X 105/孔，6孔培养皿毛乳头细胞接种量 为1X106/孔；培养条件为37°C，C0 2浓度5%，培养时间为8-10d，培养基为加入10% FBS 的DMHM培养基。
[0017] 步骤3)所述单独培养毛乳头细胞，接种到插入皿中的接种量为：24孔培养皿 1 X 105/孔，6孔培养皿1 X 106/孔。
[0018] 所述方法用于鉴定细胞是否参与毛发发育。
[0019] 本发明取得的有益效果如下：
[0020] 本发明首次实现了通过待测细胞与毛乳头细胞共培养的方式，来鉴定待测细胞是 否参与毛发发育，培养条件更加接近生物体内环境，克服了现有技术中仅仅通过单一或几 个基因或化学试剂来研究所带来的比较片面的问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为单独培养的毛乳头细胞团。
[0022] 图2为毛乳头细胞与骨膜干细胞共培养后的细胞团。
[0023] 图3为毛乳头细胞与骨膜细胞共培养的细胞团。
[0024] 图4为待测细胞验证效果；
[0025] (A，是鹿茸骨膜细胞移植部位；B，普通骨膜细胞移植部位）。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0027] 以下实施例所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试 齐U、仪器和方法。
[0028] 实施例1毛乳头细胞与骨膜干细胞共培养
[0029] 1)分离培养鹿茸骨膜干细胞：取鹿茸骨膜组织，消化，细胞培养，培养条件为 37°C，C0 2浓度为5%，培养时间为8-10d，培养基为DMEM加10% FBS。（以下培养条件于此 条件相同）。
[0030] 2)毛乳头细胞培养：离体分离鹿皮肤毛乳头细胞，消化培养。将毛乳头细胞接种 在插入式细胞培养皿的上表面，单独培养。
[0031] 3)细胞共培养：将毛乳头细胞接种在插入式细胞培养皿的上表面，鹿茸骨膜干细 胞接种在插入式细胞培养皿的下表面。共同培养至形成毛乳头细胞团。
[0032] 4)在毛乳头细胞团形成稳定后，在带有标尺功能的倒置显微镜下，观察测量毛乳 头细胞团的大小，测定结果如表1所示。通过鹿茸毛乳头细胞单独培养（图1)与鹿茸毛乳 头细胞与鹿茸骨膜干细胞共培养（图2)相比，毛乳头细胞团的大小差异明显，平均直径差 距为-0.41，低于-0. 1。鹿茸毛乳头细胞与鹿茸骨膜干细胞共培养情况下，形成的毛乳头细 胞团要小。这个结果说明鹿茸骨膜干细胞对鹿茸毛乳头细胞团发育有明显的抑制作用。 [0033] 表1.毛乳头细胞团直径测量结果（单位：Um)
【权利要求】
1. 一种鉴定参与毛发发育细胞的方法，其特征在于，先分别分离培养待测细胞和毛乳 头细胞，再分别将毛乳头细胞和待测细胞接种到插入式培养皿的上下表面进行共培养，同 时单独培养毛乳头细胞，培养结束后测定单独培养的毛乳头细胞团平均直径和共培养细胞 团平均直径，再根据判定公式判定待测细胞是否参与毛发发育。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于，所述判定公式，为： x - (b-￡l) /b 其中，a，单独培养的毛乳头细胞团平均直径；b，共培养细胞团平均直径。
3. 权利要求1所述方法，其特征在于，所述按照判定公式进行判定，是按照以下情况进 行判定： 1) 当| x |〈0.1，待测细胞不参与毛发发育； 2) 当| x |彡0. 1，待测细胞参与毛发发育，其中，x彡0. 1，待测细胞对毛发发育具有 促进作用；x < _〇. 1，待测细胞对毛发发育具有抑制作用。
4. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 分离培养待测细胞，获得待测细胞； 2) 分离培养毛乳头细胞，获得毛乳头细胞； 3) 将步骤1)所得的待测细胞接种到插入式培养皿的下表面，将步骤2)所得的毛乳 头细胞接种到插入式培养皿的上表面，进行共培养；同时在相同条件下，单独培养毛乳头细 胞，培养结束后，获得共培养细胞团和单独培养毛乳头细胞团； 4) 利用显微镜的长度标尺测定单独培养毛乳头细胞团平均直径a和共培养细胞团平 均直径b，根据判定公式x = (b_a)/a，判定待测细胞是否参与毛发发育。
5. 权利要求4所述方法，其特征在于，步骤3)所述共培养，将毛乳头细胞和待测细胞 按10:1的接种量分别接种到插入皿的上下表面，24孔培养皿毛乳头细胞接种量为1 X 105/ 孔，6孔培养皿毛乳头细胞接种量为IX 106/孔；培养条件为37°C，C02浓度5%，培养时间 为8-10d，培养基为加入10% FBS的DMEM培养基。
6. 权利要求4所述方法，其特征在于，步骤3)所述单独培养毛乳头细胞，接种到插入皿 中的接种量为：24孔培养皿1 X 105/孔，6孔培养皿1 X 106/孔。
7. 权利要求1-6所述方法，其特征在于，用于鉴定细胞是否参与毛发发育。
【文档编号】C12Q1/02GK104450858SQ201410794830
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】赵海平, 李春义, 孙红梅, 褚文辉, 刘振 申请人:中国农业科学院特产研究所