一种低温乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法
【专利摘要】本发明提供了一种低温乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，采用酸液提取和低温乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品，与传统方法通过酸液提取和硫酸铵盐析制取玻璃酸酶粗品相比，具有更高的收率。
【专利说明】一种低温乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说涉及从新鲜动物睾丸中提取玻璃酸酶粗品的方法。
【背景技术】
[0002]玻璃酸酶又名透明质酸酶，在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颁下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。
[0003]玻璃酸酶的稳定性较好，42°C加热60分钟活力不损失；100°C加热5分钟，活力可保留80%。受热失活后进行冷却可恢复部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍较稳定。在低浓度水溶液中较易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯胶或0.2%明胶保护。Fe2+、Cu2+对酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等对酶活性没有明显影响。硫酸软骨素B (皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素及高浓度玻璃酸酶对酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化钠或硫酸鱼精蛋白所逆转。
[0004]药用玻璃酸酶为白色或微黄色粉末，无气味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂。生化制药主要用牛、羊睾丸为原料进行提取制备。
[0005]低温乙醇法是1940年由美国哈佛大学医学院的Edwin J.Cohn教授发明的，因此又称为“孔氏法”。孔氏法最初用来分离牛血清白蛋白，随后应用于人血浆分离。1944年，白蛋白制品首次进行临床输注，用于抢救7名在日军偷袭珍珠港中严重烧伤的美国水兵，并由此开始了血浆蛋白制品的工业化生产。乙醇作为一种蛋白沉淀剂，具有许多优点:介电常数低、与水易混溶、在正常环境和工作条件下无易爆性、低分子量、化学上的相对惰性、低毒、价廉、易得和抑菌作用。至今，大规模血浆蛋白分离仍基本采用低温乙醇分离法。
[0006]王彦，周淑敏等曾在2002年15卷(I)期的《黑龙江医药》上发表了一篇名为《透明质酸酶提取工艺的研宄》的论文，较详细的介绍了工业生产中从羊睾丸中提取玻璃酸酶的传统工艺以及在此基础上由他们改良的新工艺；李丹，郭育涛等曾在2011年8月第40卷第8期的《应用化工》上发表了一篇名为《牛睾丸中透明质酸酶提取工艺研宄》的论文，介绍了用盐酸和乙酸的混合液溶解、硫酸铵盐析方法，从牛睾丸中提取玻璃酸酶的实验研宄。国内传统工艺都是用酸液溶解和硫酸铵盐析来提取玻璃酸酶粗品的，本专利采用酸液提取和低温乙醇沉淀来提取玻璃酸酶粗品，在国内尚属首创，国内相关论文、专利等文献资料没有低温乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相关介绍。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种低温乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，采用酸液提取和低温乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品。具体步骤如下:
I提取:
将羊睾丸除内外皮层及副睾丸，绞成糜浆。称取糜浆，按每Ikg糜浆加酸液1.0-1.5L的比例，加酸液搅拌，浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调pH3.2?4.0。
[0008]取滤渣，按每Ikg开始加入的糜浆加酸液0.2-0.3L的比例，加酸液搅拌I小时后，再次过滤，滤液调PH3.2?4.0。
[0009]所述酸液为冰醋酸，盐酸，氯化钠和水的混合酸液。
[0010]2 粗制:
合并两次过滤液，在不断搅拌下，加入预冷的无水乙醇，静置2小时使其产生沉淀，将沉淀悬浮于0.15mol/L的氯化钠溶液中，调pH形成沉淀，取上清液，将上清液调pH3.2-4.0，加入预冷的无水乙醇，静置2小时，所得沉淀即为玻璃酸酶粗品。
[0011]粗制工序需在2-6°C冷库中进行，两次无水乙醇的添加量均为开始时合并的过滤液的50%。
[0012]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
国内现有技术是用酸液溶解、硫酸铵盐析的方法来制取玻璃酸酶粗品，而本发明技术是采用酸液提取和低温乙醇沉淀来制取玻璃酸酶粗品，国内相关论文、专利等文献资料没有低温乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相关介绍，本发明首次采用低温乙醇沉淀来提取玻璃酸酶粗品，在国内尚属首创。生产工艺简易、收率高，适合大规模工业化生产。该项成果有良好的经济效益和社会效益，它不但解决国内外医疗用药的需求，还为养殖产品的综合利用开拓了新路，对养殖业的发展有积极意义。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0014]实施例1 I提取:
称取糜浆5kg加酸液6.3L，搅拌浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调PH3.49。
[0015]取滤渣加酸液1.1L，搅拌I小时后，再次过滤，滤液调pH3.57。
[0016]2 粗制:
在2-6°C冷库中合并两次过滤液7.5L，在不断搅拌下，加入预冷的无水乙醇3.75L，静置2小时使其产生沉淀，将沉淀悬浮于0.15mol/L的氯化钠溶液中，调pH形成沉淀，取上清液，将上清液调PH3.76，加入预冷的无水乙醇3.75L，静置2小时，所得沉淀即为玻璃酸酶粗品 651.42go
[0017]实施例2 I提取:
称取糜浆400g加酸液0.5L，搅拌浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调pH3.83。
[0018]取滤渣加酸液0.1L，搅拌I小时后，再次过滤，滤液调pH3.75。
[0019]2 粗制:
在2-6°C冷库中合并两次过滤液600mL，在不断搅拌下，加入预冷的无水乙醇300mL，静置2小时使其产生沉淀，将沉淀悬浮于0.15mol/L的氯化钠溶液中，调pH形成沉淀，取上清液，将上清液调PH3.67，加入预冷的无水乙醇300mL，静置2小时，所得沉淀即为玻璃酸酶粗品 52.14go
[0020]经测算，实施例1中玻璃酸酶粗品收率13.03% ;实施例2中玻璃酸酶粗品收率13.04%ο与传统方法制得的玻璃酸酶粗品收率10%左右相比，新方法的收率更高。
[0021]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种低温乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，其特征在于，采用酸液提取和低温乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品，与传统方法通过酸液提取和硫酸铵盐析制取玻璃酸酶粗品相比，具有更高的收率。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: (一)提取: 将羊睾丸除内外皮层及副睾丸，绞成糜浆，称取糜浆加酸液，搅拌、浸渍，过滤，滤液调PH ;取滤渣再加酸液，搅拌、过滤，滤液调pH ;所述酸液为冰醋酸，盐酸，氯化钠和水的混合酸液； (二)粗制: 合并两次过滤液，在不断搅拌下，加入预冷的无水乙醇，静置2小时使其产生沉淀，将沉淀悬浮于氯化钠溶液中，调PH形成沉淀，取上清液，将上清液调pH3.2-4.0，加入预冷的无水乙醇，静置2小时，所得沉淀即为玻璃酸酶粗品。
3.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，第一次每Ikg糜浆加酸液1.0-1.5L，第二次酸液仍根据开始糜浆量加入，每Ikg糜浆加酸液0.2-0.3L。
4.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，酸液提取后调节滤液的pH值均为3.2?4.0。
5.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(二)需在2-6°C冷库中进行。
6.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(二)中两次无水乙醇的添加量均为开始时合并的过滤液的50%。
7.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(二)中氯化钠溶液的浓度为0.15mol/L0
【文档编号】C12N9/26GK104498452SQ201410807799
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】刘乃山, 宋超龙, 刘翠珍 申请人:青岛康原药业有限公司