鸡γ干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种鸡γ干扰素表达基因改造方法以及利用该方法改造得到的基因，上述方法及基因专门针对以大肠杆菌为宿主的表达系统。本发明的基因改造方法是在鸡γ干扰素天然表达基因的基础上将其中大肠杆菌的稀有密码子替换为非稀有密码子，从而提升了大肠杆菌对鸡γ干扰素及其衍生蛋白的表达效率。本发明所提供的基因，其表达的蛋白作为鸡γ干扰素蛋白衍生物具有鸡γ干扰素的活性且活性较天然鸡γ干扰素高，同时它以可溶蛋白的形式高效表达，表达后最高可占表达蛋白的50％以上，无需包涵体变复性等操作，通过一步纯化后纯度可达到95％；生产周期短，成本低；还具有很好的免疫调节活性和抗病毒活性，为该鸡γ干扰素的规模化生产奠定了良好的基础。
【专利说明】鸡Y干扰素表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基 因
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种鸡Y干扰素表达基因改造方法、利 用该方法改造得到的基因。
【背景技术】
[0002] 干扰素是一种低分子量的可溶性蛋白，目前一般将干扰素分为I、II、III型，其结 构、受体和来源有所区别，活性侧重点也不同。干扰素功能主要有抗病毒、免疫调节和抗肿 瘤。而II型干扰素（IFN-Y)其免疫调节能力是I型干扰素的数百倍，又因其是机体自身 携带不会出现排异反应，所以是理论上十分理想的免疫佐剂。
[0003] ChIFN-Y可增加单核细胞和巨噬细胞表面IgG Fc受体表达，从而参与免疫复合 物的清除、吞噬作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒（Antibody-dependent cell-mediated cyt〇t〇Xicity，ADCC)作用。ChIFN-γ能使抗原呈递细胞表达MHC-II类抗原的数量显著增 力口、增强抗原呈递细胞与T细胞的相互作用，增加辅助T细胞（T-helper cell，Th)的数量 和增强迟发型超敏反应（Delayed type hypersensity，DTH);能增强细胞毒T细胞和自然 杀伤（Natural killer，NK)细胞杀伤靶细胞的能力；能诱导细胞表达IL-2受体，从而促进 T细胞增殖，进一步扩大免疫应答。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡Y干扰素表达基因改造方法、 利用该方法改造得到的基因，以解决现有技术中利用大肠杆菌表达鸡鸡Y干扰素产率较 低的技术问题。
[0005] 本发明解决的另一技术问题是通过对鸡Y干扰素表达基因的改进从而提升其所 表达的鸡Y干扰素蛋白向胞外分泌的作用。
[0006] 本发明解决的又一技术问题是通过对鸡Y干扰素表达基因的改进从而便于其所 表达的鸡Y干扰素蛋白后期纯化。
[0007] 本发明解决的再一技术问题是通过提供利用上述改造基因表达鸡Y干扰素的方 法，以提升表达效率。
[0008] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种鸡Y干扰素表达基因改造方法，该方法在鸡Y干扰素天然表达基因的基础 上以大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀有密码子。
[0010] 优选的，所述鸡Y干扰素表达基因所表达的蛋白质N端对应的核苷酸上连接有信 号肽或利用表达载体上的信号肽。
[0011] 优选的，所述鸡Y干扰素表达基因末端具有标签蛋白；在此基础上进一步优选 的：所述标签蛋白可以是His标签、Arg标签、FLAG标签或GST标签的其中一种。
[0012] 本发明还提供了一种利用上述方法改造得到的鸡Y干扰素表达基因，其核苷酸 序列如SEQ ID N02所示。
[0013] 同时，本发明还提供了一种利用该基因表达鸡Y干扰素方法，包括以下步骤：将 该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-β -D-硫代吡喃 半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为〇. 1?lmm〇l/L，诱导温度为16?37°C，诱导 表达时间为3?16小时。
[0014] 优选的，所述表达载体是pBV220、pET系列载体或pQE系列载体的任一种；在此基 础上更优的，所述表达载体是pET-28a (+)。
[0015] 优选的，所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5 α、大肠杆菌BL21 (DE3)或大肠杆菌JM109。
[0016] 本发明提供的方法及基因专门针对原核表达系统，尤其是以大肠杆菌为宿主的表 达系统，因此本发明的基因改造方法是在鸡Y干扰素天然表达基因的基础上将其中大肠 杆菌的稀有密码子替换为非稀有密码子，从而提升了大肠杆菌对鸡Y干扰素及其衍生蛋 白的表达效率。在此基础上，本发明通过对鸡Y干扰素表达基因密码子的取代、添加或缺 失实现了改造后基因所表达的蛋白具有鸡Y干扰素的生物活性。此外，本发明通过在鸡Y 干扰素表达基因上增加信号肽基因从而使得所表达蛋白N端连接有信号肽，进而促进蛋白 分泌到细胞周质或培养基中。此外，本发明通过在鸡Y干扰素表达基因上增设标签蛋白基 因从而使得所表达的蛋白N端或C端连接有标签蛋白，进而便于后期分离纯化。
[0017] 本发明提供的序列如SEQ ID Ν02所示的基因与鸡Y干扰素天然表达基因的核苷 酸数量均为438个，所表达的蛋白其氨基酸数量相同，但二者序列存在一定程度的差异。本 发明SEQ ID Ν02所示基因表达的蛋白作为鸡γ干扰素蛋白衍生物具有鸡γ干扰素的活性 且活性较天然鸡Y干扰素高，同时它以可溶蛋白的形式高效表达，表达后最高可占表达蛋 白的50%以上，无需包涵体变复性等操作，通过一步纯化后纯度可达到95% ;生产周期短， 成本低；还具有很好的免疫调节活性和抗病毒活性，为该鸡Y干扰素的规模化生产奠定了 良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是鸡Y干扰素天然表达基因（ChIFN-Y-N)与本发明SEQ ID Ν02序列 (ChIFN-γ-0)对比图；
[0019] 图2是天然鸡Y干扰素氨基酸序列与本发明SEQ ID Ν03序列对比图；
[0020] 图3是琼脂糖凝胶电泳检测ChIFN- Y -0基因的PCR扩增结果，其中M为Marker， LI为PCR产物电泳结果，L2为阴性对照；
[0021] 图4 =SDS-PAGE检测诱导后与未经诱导的ChIFN-Y-O蛋白在大肠杆菌中的表达结 果，其中Ml为非预染蛋白Marker，M2为预染蛋白Marker ;L1为未诱导的对照组，L2为诱导 后菌体的全诱导产物，L3、L4依次为诱导后菌体破碎沉淀和上清；
[0022] 图5 :SDS_PAGE检测ChIFN- Y -0蛋白的阳离子交换层析纯化结果，其中M为非预 染蛋白Marker，Ll为纯化前的样品，L2为上样流穿液，L3为Tris-HCl洗涤，L4为0. 2 M NaCl洗涤，L5为0. 5M NaCl洗脱产物（即ChIFN- γ -0蛋白），L6为0. 2 M NaCl洗涤；
[0023] 图6 :禽流感疫苗和（或）ChIFN- Y -0蛋白免疫后，HI抗体效价检测结果；
[0024] 图7 :新城疫疫苗和（或）ChIFN- Y -0蛋白免疫后，HI抗体效价检测结果；
[0025] 图8 :法氏囊灭活疫苗和（或）ChIFN- Y -0蛋白免疫后，HI抗体效价检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0027] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约1〇〇"表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0028] 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0029] 以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0030] 实施例1
[0031] 本实施例描述了本发明提供的天然的鸡Y干扰素（ChIFN- γ -N)基因与优化的鸡 Y干扰素（ChIFN-γ-Ο)基因的获得方法。
[0032] 根据GeneBank中FJ788637的mRNA序列，在去除信号肽序列后，即为本发明提供 的天然的鸡Y干扰素（ChIFN-Y-N)基因的核苷酸序列（见SEQ ID N01)。
[0033] 通过大肠杆菌（E. coli)密码子分析软件的分析，并根据大肠杆菌对密码子的偏 爱性，对天然的鸡Y干扰素（ChIFN-Y-N)基因进行了替换稀有密码子、调节GC含量等优 化；天然的Y干扰素在C端含有两个半胱氨酸，本发明研究发现，这两个半胱氨酸对干扰素 的生物活性并无影响。所以优化基因，使其突变成性质类似的丝氨酸。通过以上优化，即获 得了优化后的鸡Y干扰素（ChIFN-Y-O)基因（见SEQ ID N01)，使其能够在大肠杆菌中高 效表达。
[0034] 实施例2
[0035] 本实施例描述了含ChIFN- Y -0基因的重组质粒与工程菌的构建。
[0036] 一、ChIFN- Y -0 基因的扩增
[0037] 根据上述ChIFN-Y-0基因序列，利用Primer Premire软件设计引物，同时分别在 引物的5'端引入Nco I酶切位点，3'端引入Hind III酶切位点：
[0038] 上游引物（Fl) :5'-CCATGGGTCATACCGCAAGCAGCCTG-3'（划线部分为 Nco I 酶切位 点）；
[0039] 下游引物（Rl) :5' -AAGCTTTTAGCTATTGCTACGACGC-3' (划线部分为 Hind III 酶切 位点）。
[0040] 以合成的ChIFNi -0基因序列为模板，以Fl和Rl为引物进行PCR扩增，反应体 系含模板lug，上下游引物各ΙμΜ，总反应体系是50μ? ;反应条件为：94°C、5min;94°C、 30sec，54°C、30sec，72°C、45sec，30 个循环；72°C，10min。PCR 产物经 L 5%琼脂糖凝胶电 泳检测，检测结果如附图3所示。其中，M为Marker，Ll为PCR产物的电泳结果，L2号为阴 性对照，结果表明在450bp左右有清晰条带。
[0041] 二、重组质粒及工程菌的构建
[0042] 1.使用DNA回收试剂盒回收PCR产物。
[0043] 2.用限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切已回收的PCR扩增产物，得到酶切产 物；
[0044] 3.用限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切表达载体pET-28a(+)，利用DNA回 收试剂盒回收载体骨架；
[0045] 4.将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架，用T4 DNA连接酶16°C连接过夜，即 得到连接产物；
[0046] 5.将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切 鉴定：1)菌落PCR使用引物为Fl和Rl，结果在450bp左右有清晰单一条带的菌落为阳性菌 落；2)酶切鉴定所用的酶为限制性内切酶Nco I和Hind III，同时在450bp和5300bp左右 有清晰单一条带的菌落为阳性菌落；3)将以上检定结果都为阳性的重组质粒交由华大基 因进行DNA测序。测序正确的即为目的重组质粒,命名为ChIFN- γ -pET-28a。
[0047] 6.将重组质粒ChIFN- γ -pET-28a转化大肠杆菌BL21 (DE3)，后筛选单菌 落，并进行酶切验证。结果为阳性的菌落，即为目的重组工程菌，命名为的宿主菌为 BL21 (DE3)-ChIFN-y-pET-28a(+) 〇
[0048] 实施例3
[0049] 本实施例描述了重组工程菌BL21(DE3)-ChIFN-Y-pET-28a(+)的诱导表达，及其 表达的重组鸡Y干扰素（ChIFN-Y-O)的纯化。
[0050] 一、重组工程菌 BL21(DE3)-ChIFN-Y-pET-28a(+)的诱导表达
[0051] 1.将重组工程菌BL21(DE3)-ChIFN-Y-pET-28a(+)接种于IOOmL含氨苄抗性 (Kan +)的液体LB培养基中，在37°C、200rpm的摇床上震荡培养，至OD6c?值为0. 8时，添加 诱导物IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，终浓度0. 5mM) 180rpm继续诱导培养，诱导 时间为5小时；同时设对照组，除不加诱导物IPTG外，其他操作相同。
[0052] 2.分别取诱导和未诱导的发酵培养液各取5mL，8000-10000rpm离心20min收集菌 体。然后加入500 μ L Tris-HCl (PH 7. 9)重悬菌体，超声破碎后，HOOOg离心lOmin，分别 收集上清与沉淀（沉淀依然使用500 μ L Tris-HCl重悬）。
[0053] 3.取以上4种样品各60 μ L，分别加入20 μ L 4Χ蛋白上样缓冲液（含DTT)，混匀 后煮沸5-10分钟。然后各上样10 μ L进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检测结果如图4所示， 诱导后（L2-L4)在16kD左右处出现一条蛋白条带，与预期大小相符；ChIFN-γ-O蛋白的表 达占全部菌体蛋白的50 %左右，可溶性表达的ChIFN- γ -O蛋白占全部可溶蛋白的47 %左 右。
[0054] 二、重组鸡Y干扰素（ChIFN-γ-Ο)的纯化
[0055] 1.收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 mL Tris-HCl (PH 7. 9)重悬，超 声裂解菌体。
[0056] 2. 14000g、4°C离心10分钟，收集离心上清液。
[0057] 3.使用蛋白监测仪监测，以50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)冲洗层析柱至平衡后，即可 开始上样。用50mM Tris-HCKpH = 8. 0)将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为2mL/ min〇
[0058] 4.使用50mM Tris-HCl (pH = 8· 0)冲洗柱子，洗去杂蛋白，流速为4mL/min。
[0059] 5.使用 0· 2M NaCl (50mM Tris-HCl，pH = 8. 0)洗涤杂蛋白，流速为 4mL/min。
[0060] 6.使用 0· 5M NaCl (50mM Tris-HCl，pH = 8. 0)洗脱目的蛋白，流速为 4mL/min。 收集洗脱峰。
[0061] 7.使用 IM NaCl (50mM Tri s-HCl，pH = 8. 0)彻底洗净柱上蛋白。
[0062] 8.纯化过程中每步需各取60yL的样品，分别加入20yL 4X蛋白上样缓冲液 (含DTT)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10 μ L进行SDS-PAGE电泳检测，电泳检测结 果如图5所示。结果显示，洗脱收集的ChIFN-Y-O蛋白，纯度能够达到95%以上（图5， L5)。
[0063] 实施例4
[0064] 本实施例描述了重组鸡Y干扰素（ChIFN-Y-O)蛋白的体内和体外测活，显示了 其对鸡体的免疫功能调节，从而增强了多种禽类疫苗的免疫效果；同时也显示了一定的抗 病毒活性。这些禽类疫苗包括禽流感病毒，新城疫病毒，法氏囊病毒。按方差分析法对数据 进行统计学处理，显著水平为Ρ〈〇. 05。
[0065] 一、重组蛋白的体外活性检测
[0066] 根据《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》中猪白细胞干扰素的效价检验方 法（细胞病变抑制法）进行生物学特性的体外活性检测，通过检测发现表达的目的蛋白具 有生物活性。
[0067] 二、重组蛋白的体内活性检测
[0068] 1.与禽流感二价苗联合免疫
[0069] 禽流感Η5、Η9二价油苗与重组干扰素联合免疫7日龄的SPF鸡。将SPF鸡分为4 组，每组30只，具体免疫方法见表1，免疫方式为右胸皮下注射。
[0070] 每组分别于免疫后第0、7、14、28、35、42日进行翅静脉采血，分离血清，检测血凝 抑制效价，结果表明干扰素组可以较早产生抗体，且抗体水平明显高于疫苗组，维持时间也 较长，具体结果见图6。
[0071] 免疫后28天（35日龄），通过点眼途径攻毒，每只0.5ml毒液，观察并记录鸡群的 精神状态、饮食情况及死亡情况，并对病死鸡进行剖检并记录病理变化，于攻毒第3日、5日 和7日，采集喉头和泄殖腔拭子样本，进行病毒分离。
[0072] 表1禽流感免疫试验分组及免疫情况（AIV)
[0073]
【权利要求】
1. 一种鸡Y干扰素表达基因改造方法，其特征在于：在鸡Y干扰素天然表达基因的 基础上以大肠杆菌非稀有密码子替换其中的大肠杆菌稀有密码子。
2. 根据权利要求1所述的一种鸡Y干扰素表达基因改造方法，其特征在于：所述鸡Y 干扰素表达基因所表达的蛋白质N端对应的核苷酸上连接有信号肽或利用表达载体上的 信号肽。
3. 根据权利要求1所述的一种鸡Y干扰素表达基因改造方法，其特征在于：所述鸡Y 干扰素表达基因末端具有标签蛋白。
4. 根据权利要求4所述的一种鸡Y干扰素表达基因改造方法，其特征在于所述标签蛋 白为His标签、Arg标签、FLAG标签或GST标签的其中一种。
5. -种利用权利要求1所述方法改造得到的鸡Y干扰素表达基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N02 所示。
6. -种利用权利要求5所述基因表达鸡Y干扰素方法，其特征在于包括以下步骤：将 该基因插入表达载体中，而后将该重组表达载体导入大肠杆菌，以异丙基-3 -D-硫代吡喃 半乳糖苷为诱导物进行诱导表达，诱导浓度为〇. 1?lmm〇l/L，诱导温度为16?37°C，诱导 表达时间为3?16小时。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述表达载体是pBV220、pET系列载体或 PQE系列载体的任一种。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述表达载体是pET-28a (+)。
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5ci、大肠杆菌 BL21(DE3)或大肠杆菌JM109。
【文档编号】C12N15/70GK104404051SQ201410811261
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】侯伟宏, 王甜, 梁武, 苏建东, 杨保收 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司